双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒

神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT-PCR产物421bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%。将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelusspp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上。对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒。结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原。RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”李矮缩病毒

为选择不携带主要病毒的植株,利用作者已建立的PDVRT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带PDV的情况进行了调查,结果表明,被检植株PDV的感染率达90%,但程度不同。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测罗氏沼虾诺达病毒

用逆转录聚合酶链式反应方法,检测5尾来自广西某罗氏沼虾养殖场典型白肉病症状罗氏沼虾肌肉中的诺达病毒,结果是阳性5尾,占100%。该检测方法耗时短,特异性、实用性强,灵敏度高。

逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”主要病毒

目的:调查“歇马杏”携带主要病毒的情况。方法:利用作者已建立的ACLSV、PNRSV和PDV RT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带三种病毒的情况进行了调查。结果:被检植株ACLSV、PNRSV和PDV的单独感染率分别为83.33%、83.33%和90%,复合感染率达到76.67%,但带毒程度不同。

利用逆转录酶的聚合酶链式反应检测外周血中的肿瘤细胞

本文就RT-PCR技术检测外周血中肿瘤细胞的基本原理及其在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等检测中的应用加以综述。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测石斑鱼神经坏死病毒方法的建立和应用

神经坏死病毒是导致石斑鱼等多种海水鱼类暴发性传染病的致病原。根据石斑鱼神经坏死病毒编码核衣壳蛋白的RNA2基因组序列设计的一对特异性引物,用来扩增其中的421bp病毒核酸片段。比较了酚-氯仿法、试剂盒法等3种RNA抽提的方法对神经坏死病毒的核酸抽提效果,结果表明3种方法均适合于RT-PCR方法。实验证明在cDNA过程中,RNA酶抑制剂并非反应所必需。对RT-PCR过程进行了条件优化,建立了一步法的RT-PCR检测方法,在网箱养殖石斑鱼以及育苗场的病鱼检测实践中获得满意效果。

实时逆转录聚合酶链式反应检测活的金黄色葡萄球菌

针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。

小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立

目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。

实时RT-PCR检测人端粒酶逆转录酶mRNA用于乳腺癌鉴别诊断及与c-Myc基因的相关性

目的探讨定量检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA在乳腺癌鉴别诊断中的价值,并观察原癌基因c-Myc与hTERT mRNA表达的关系。方法收集癌旁正常乳腺组织、乳腺普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌病例,采用实时荧光定量RT-PCR技术(Real-ti me RT-PCR)定量检测hTERT和c-Myc基因的转录水平。结果以NhTERT=10为临界值,所有正常组织和良性病变NhTERT值均小于临界值,而hTERT基因转录升高的导管原位癌及浸润性导管癌其NhTERT值均大于此临界值。显示hTERT和c-Myc基因转录水平呈正相关(γ=0.7395,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR技术检测hTERT基因表达具有高敏感性和特异性,能为常规病理学诊断提供客观的参考指标,从而提高乳腺不典型导管增生与导管原位癌鉴别诊断的准确性。原癌基因c-Myc转录水平上调可能与乳腺癌hTERT基因转录激活有关。

重组逆转录病毒质粒pLNCX/iNOS的构建

目的 构建含一氧化氮合酶 (iNOS)基因的重组逆转录病毒 pLNCX/iNOS质粒。 方法 用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长DNA ,用限制性内切酶HindⅢ和ClaⅠ对i NOSDNA和逆转录病毒质粒pLNCX分别进行双酶切。在T4连接酶的作用下 ,构建重组逆转录病毒质粒 pLNCX/iNOS ;用脂质体介导的方法把重组质粒DNA转染进入包装细胞PA317中 ,经过G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒液的病毒滴度。结果 经过酶切分析证实PCR扩增的iNOSDNA基因序列与鼠源性iNOS基因序列完全一致。重组质粒经酶切分析与预期的结果一致。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 1× 10 4 CFU/ml。结论 逆转录病毒载体

逆转录-PCR扩增文昌鱼LIM类同源框基因片段

于1997年6月在青岛市沙子口海域采集文昌鱼样品，采用RT-PCR方法进行青岛文昌鱼LIM类同源框基因片段的扩增研究。结果表明，用一对引物一次PCR扩增的方法未能得到特异的PCR产物，用一对引物两次PCR扩增的方法也同样未果。在对套式PCR进行研究时发现，用普遍PCR方法进行的套式PCR结果不够理想，而用三步两段法和四步两段法套式PCR则可进行成功的扩增。用这两种方法扩增的PCR产物具有高度特异性。相比之下，用简并的引物对未知的基因片段进行PCR扩增时，三步两段法和四步两段法的套式PCR应是首选方法。

检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。

直接逆转录原位PCR检测实验性汉坦病毒感染乳鼠脑组织中病毒RNA及其与原位分子杂交的比较

出生后２～３ｄ的昆明种乳鼠，经腹腔接种１００个半数致死量的陈株汉坦病毒，每只０．０５ｍｌ，于接种后１、２、４、６、８、１０、１２、１４ｄ处死动物，每个时间点３～６只不等，取其脑组织固定于４％的多聚甲醛中，石蜡包埋制备５μｍ的连续组织切片，每时间点取１～２例组织切片，用逆转录原位ＰＣＲ（ＲＴ－ＩＳＰＣＲ）方法检测组织中病毒Ｓ片段ＲＮＡ，组织脱蜡后，经ＤＮａｓｅ、蛋白酶Ｋ、消化等予处理，用汉坦病毒ＲＮＡＳ片段特异的一对引物，在组织切片上进行病毒ＲＮＡ的逆转录和ＰＣＲ过程，直接将ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ掺入到扩增产物中，经过３０个ＰＣＲ循环后，用碱性磷酸酶标记的抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体免疫组化检测扩增产物，连续组织切片用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的汉坦病毒Ｍ片段Ｇ２编码区ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的和Ｓ片段特异性探针进行原位分子杂交并与ＲＴ－ＩＳＰＣＲ结果进行比较，另外应用免疫组化检测该基因表达产物病毒核抗原（ＮＰ），结果，ＲＴ－ＩＳＰＣＲ在病毒感染１ｄ的乳鼠脑组织中检测到病毒ＲＮＡ扩增产物，扩增产物定位于神经细胞胞浆内，而原位分子杂交和免疫组化检测阴性。在病毒感染２ｄ及２ｄ以后的乳鼠脑组织中ＲＴ－Ｉ?

单向聚合酶链式反应扩增法研究

:c DNA的末端快速扩增 (RACE)是获得全长 c DNA的有效手段之一。本文论述了 RACE技术的原理、方法和改进 ,并介绍了新型 RACE技术。

一步法逆转录荧光定量PCR检测食源性沙门氏菌

建立采用一步法逆转录荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测食源性沙门氏菌的检测方法并初步应用。以沙门氏菌的invA基因为目的基因设计引物,优化PCR反应体系和反应条件,同时进行特异性、灵敏度和重复性实验;并用所建立的方法检测人工污染的猪肉样品,通过与传统计数方法的结果对比验证所建立方法的适用性。优化后的逆转录荧光定量PCR检测条件为:42℃、5min,95℃、10s,95℃、5s,67℃、34s;此步骤进行40个循环;上、下游引物的最佳终浓度均为0.16μmol/L。结果表明:该方法的特异性为100%;重复性良好;对沙门氏菌的检测下限为150CFU/mL;检测人工污染食品样品的结果100%符合传统计数结果。建立的检测方法具有快速、灵敏、简单等特点,非常适用于食源性沙门氏菌的检测。

逆转录—聚合酶链式反应检测大肠癌患者淋巴结微转移

目的探讨大肠癌患者淋巴结的微转移及其临床意义.方法采用苏木素-伊红(HE)病理切片染色和细胞角蛋白20(CK20)的RT-PCR 法检测了经病理证实的39例大肠癌患者的260枚淋巴结的肿瘤转移情况.10 枚正常淋巴结为阴性对照,HT29结肠癌细胞和5例大肠癌标本为阳性对照.结果 10枚正常淋巴结CK20表达阴性,HT29细胞和大肠癌标本CK20表达阳性.HE 染色查见转移的1 6例患者的29枚淋巴结CK20 mRNA全部阳性,而在组织学未见转移的淋巴结中,有5例患者的28枚呈CK20阳性表达,即存在癌转移,显示两种方法的检测结果差异显著(11.1%和21.9 %,P<0.01).按照HE染色结果,Dukes' A、B、 C和D期的病例数分别为3、20、12和4 例,在20例Dukes' B期患者中,5例有CK20表达阳性的淋巴结.结论 CK20的RT-PCR检测是发现肿瘤淋巴结微转移的敏感、特异和简便的方法.大肠癌患者淋巴结CK20 mRNA 的检测可用于大肠癌的准确分期和围手术期辅助治疗方案的选择,但需进一步研究加以证实.

转录因子κB和早期生长反应因子1在急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠模型中的表达

目的研究转录因子核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和早期生长反应因子1(early growthresponse factor-1,Egr-1)在急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠模型中的表达及意义。方法将α-异硫氰酸萘酯(ANIT)按50 mg/kg 一次灌胃大鼠,建立急性肝内胆汁淤积性肝损伤的动物模型,免疫组织化学法和实时荧光定量 PCR 分别检测灌胃后24、48、72 h 肝组织中 NF-κB p65蛋白表达和 Egr-1 mRNA 表达量,全自动生化分析仪检测血清总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)。结果模型组24、48、72 h 肝组织 Egr-1 mRNA 表达量分别为(12.73±3.02)×10^(-2)、(8.19±2.29)×10^(-2)、(5.79±0.78)×10^(-2),24、48 h 均高于对照组(P 均<0.05),72 h 与对照组差异无统计学意义(P>0.05);模型组24、48、72 h肝组织 NF-κB p65核表达阳性细胞率分别为48.3%、26.5%、2.7%,其中24、48 h 均高于对照组(P 均<0.05),72 h 与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。模型组24、48 h NF-κB p65核表达阳性细胞分级分别与同一时间点的血清 TB、DB、ALT 呈正相关(P 均<0.05);模型组24、48 hEgr-1 mRNA 表达量分别与同一时间点的血清TB、DB、AIT、GGT 呈正相关(P 均<0.05);模型组72 h 肝组织 NF-κB p65、Egr-1 mRNA 表达量与72 h 时血清 TB、DB、ALT、GGT 无相关关系(P 均>0.05);模型组24、48 h NF-κB p65核表达阳性细胞分级与同一时间点的血清 GGT 亦无相关关系(P 均>0.05);模型组24、48 h 肝组织 Egr-1 mRNA 表达量及 NF-κB p65核表达阳性细胞分级均与同一时间点肝组织病理损伤程度分级呈正相关(P 均<0.05);模型组72 h 肝组织 Egr-1 mR-NA 表达量及 NF-κB p65核表达阳性细胞分级均与同一时间点肝组织病理损伤程度分级无相关关系(P 均>0.05)。结论 NF-κB和 Egr-1在肝内胆汁淤积性肝损伤肝组织中表达增高,与肝损伤程度相关,参予了肝内胆汁淤积性肝损伤的病理过程。[临床儿科杂志,2008,26(10):879-884]