双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

荧光聚合酶链反应法用于新型冠状病毒核酸检测扩增产物污染治理的相关应用

目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)法用于新型冠状病毒(新冠病毒)核酸检测时扩增产物污染治理的相关应用。方法建立新冠病毒基因检测扩增产物污染模型、物面污染模型以及空间(气溶胶)污染模型,比较不同化学试剂及物理紫外线照射治理方式对物面污染和空间污染的清除效果。结果75%乙醇消毒剂组、核酸清除剂组和不同浓度有效氯制剂组的循环阈值(CT值)均明显高于对照组,其中核酸清除剂组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为34.74±2.63、34.68±3.25、35.71±3.07。500、1000、1500、2000、2500 mg/L有效氯制剂组对不同材质的CT值均高于75%乙醇消毒剂组,且有效氯的浓度越高,CT值越大,差异均有统计学意义。不同时长紫外线照射各组的CT值均明显高于对照组;其中以紫外线照射120 min组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为35.51±2.70、35.49±2.63、35.55±2.58,且紫外线照射时长越长,CT值越大,差异均有统计学意义。治理后的通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂组的CT值为36.98±3.47,明显高于治理前及其他各组,差异均有统计学意义。结论荧光PCR法用于新冠核酸检测时扩增产物污染的治理方式较多,对物面污染的治理方式可选择核酸清除剂及2500 mg/L有效氯制剂,以及紫外线照射120 min,对空间污染环境的治理方式可选择通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂联合应用,值得重视。

基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术的苹果病毒新型快速检测方法

利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),为苹果病毒的快速检测提供技术支持。以苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)为检测对象,通过特异性RPA引物设计以及反应条件优化,对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,所设计的RPA引物特异性高,反应温度为37℃,反应时间为20 min,RT-RPA对4种苹果病毒的检测灵敏度为9.63×10^(1) copies,是普通RT-PCR的10^(2)~10^(3)倍。所建立的RT-RPA检测方法具有等温反应、检测速度快、灵敏度高等优点,可以用于快速检测苹果病毒病。

逆转录聚合酶链反应与常规法检测蚊体内黄病毒的比较研究

目的：检测比较蚊体内的黄病毒。方法：采用RT－PCR技术及常规的C6／36细胞培养结合免疫荧光法。结果：无论实验感染的登革热病毒蚊虫标本，还是从野外捕捉的标本，均表明RT－PCR检出黄病毒的阳性率比常规法高，且快速、敏捷，操作简便；常规法检出周期长（2～3周），操作复杂、繁琐和反复多次，检出率低。但常规法能通过细胞病变，观察病毒的毒力，这是RT－PCR所不及的。结论：以RT－PCR结合常规法进行虫媒病毒的研究，将更有利于探索蚊虫与虫媒病毒的关系和内在规律。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

柑橘叶斑驳病毒的逆转录重组酶聚合酶扩增检测

【目的】建立柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus,CLBV)逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA)的快速检测体系,为该病毒提供快速、简便的检测方法。【方法】以CLBV ORF1保守序列为靶标,通过设计、筛选特异性检测引物、优化反应温度和反应时长等条件建立CLBV的RT-RPA检测体系。分别以感染CLBV、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)、柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘裂皮类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus,CTLV)、柑橘鳞皮病毒(citrus psorosis virus,CPsV)、温州蜜柑萎缩病毒(satsuma dwarf virus,SDV)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)和柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)的柑橘核酸为模板,应用该体系进行RT-RPA扩增,评价检测特异性;利用CLBV阳性样品核酸的10倍浓度梯度稀释模板,比较RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR的检测灵敏度;通过比较上述3种方法对72份柑橘样品的CLBV检出率,检验所建立RT-RPA法的适用性。【结果】以感染了CLBV的柑橘核酸样品为模板,通过对设计的3对引物筛选试验、6个温度和5个反应时长的梯度试验,建立了CLBV的RT-RPA检测体系,明确引物RCLBV-F/RCLBV-R2能够特异扩增CLBV ORF1序列,且扩增效果良好,目的片段大小为144 bp,反应最适温度为40℃,反应最佳时长为30 min。在感染CLBV、CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CPsV、SDV、Xcc和CLas的柑橘样品、健康对照和空白对照中,该体系仅在CLBV侵染样品中扩增出预期大小的特异性目的条带,说明建立的RT-RPA检测体系特异性强;灵敏度检测结果表明,RT-RPA和RT-PCR的检测灵敏度相当,但低于RT-qPCR;所建立的RT-RPA方法在72份柑橘样品中检测出11份样品为CLBV阳性,检出率为15.28%,该结果与普通RT-PCR和RT-qPCR检测方法的检测结果一致。【结论】建立了CLBV的RT-RPA检测体系,该体系具有耗时短、操作简便、特异性强等优点,适用于田间一定规模柑橘样品的检测。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

四重逆转录重组酶聚合酶等温扩增技术快速联检四种难鉴别蚊媒病毒的效果观察

目的建立针对登革病毒(DENV)、黄热病毒(YFV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、寨卡病毒(ZIKV)的四重逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)技术,用于同时快速检测上述4种病毒。方法通过正交设计建立检测4种蚊媒病毒(DENV、YFV、CHIKV、ZIKV)的四重RT-RPA反应体系。通过质粒标准品、体外转录RNA和临床血清验证单重RT-RPA和四重RT-RPA的检测灵敏度、特异度、重复性和临床应用符合率。结果单重RT-RPA对DENV、YFV、CHIKV、ZIKV质粒DNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、<1×10^(2) Copies/ml,对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV体外合成RNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2) Copies/ml,四重RT-RPA对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV质粒DNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2) Copies/ml,对体外合成RNA的检出限分别为5×10^(2)、5×10^(2)、5×10^(2)、5×10^(2) Copies/ml。本研究建立的单重及四重RT-RPA反应体系与其他常见病毒不存在交叉反应,RT-RPA法测定的阈值时间值(TT)的变异系数为1.76%~5.96%。四重RT-RPA法对不同病毒体外转录RNA检出率不同,DENV、YFV和CHIKV为100.00%,ZIKV为83.33%。单重RT-RPA、四重RT-RPA、RT-PCR对DENV临床样本的检出率无统计学差异(P>0.05)。结论本研究建立的针对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的单重RT-RPA和四重RT-RPA检测方法特异度好、灵敏度高、重复性好,对蚊媒传染病的早期诊断及鉴别诊断具有重要作用,同时也为其他新发再发传染病的快速诊断方法建立提供研究方向。

细胞裂解法对植入前诊断中聚合酶链反应扩增效率的影响

目的 :探讨优化细胞裂解条件 ,提高植入前诊断中聚合酶链反应的扩增效率。方法 :吸取单个淋巴细胞或人胚胎单卵裂球 ,用碱裂解液、蛋白酶K裂解液和改良的蛋白酶K裂解液进行处理 ,随后以巢式 -聚合酶链反应扩增人肾上腺脑白质营养不良基因 (ALD基因 )的 3号外显子 ,比较其扩增效率。结果 :三种裂解液组对人淋巴细胞的扩增效率分别为 90 % ,74 % ,87% ,对人单卵裂球的扩增效率分别为 98% ,77% ,96 %。结论 :在植入前诊断中 。

结核分枝杆菌荧光定量聚合酶链反应与噬菌体生物扩增法早期诊断结核性渗出性胸膜炎的应用价值

目的:探讨荧光定量聚合酶链反应检测技术与噬菌体生物扩增法在早期诊断结核性渗出性胸膜炎的临床应用价值。方法:对145例结核性渗出性胸膜炎患者行胸腔穿刺抽液术,标本送检结核分枝杆菌的荧光定量聚合酶链反应、噬菌体生物扩增法检测,并对两种方法进行比较。结果:荧光定量聚合酶链反应检测阳性率53.1%,高于噬菌体生物扩增法32.4%,P<0.01有极显著差异,聚合酶链反应检测明显优于噬菌体生物扩增法。结论:结核分枝杆菌的荧光定量聚合酶链反应对早期诊断结核性渗出性胸膜炎有重要的诊断价值;噬菌体生物扩增法有一定参考价值。

扇贝防御素基因改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应筛选方法的研究

目的应用改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应(RACE)筛选扇贝抗菌肽基因,寻找基于基因序列同源性的双壳类抗菌肽(AMP)的筛选方法。方法 TRIzol法提取扇贝血淋巴中总RNA。根据贻贝抗菌肽的保守序列设计基因特异性简并引物,进行改良5′RACE钓取可能防御素基因cDNA的5′端序列、AT克隆、DNA测序和同源性分析。结果采用改良5′RACE从扇贝血淋巴RNA中得到多个未知基因的cDNA 5′端序列,挑选600bp以下的基因片段进行AT克隆和DNA测序后得到3个插入片段序列,其长度分别为257、275和511bp。通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库,未发现与之高度同源的基因。结论从扇贝血淋巴中获得的3个5′端cDNA序列可能属于新的基因。应用改良5′RACE能钓取含防御素保守序列的新基因片段,由此表明此方案具有可行性。

逆转录PCR扩增杂交瘤细胞内特异性免疫球蛋白重链可变区基因

目的 利用细胞内逆转录PCR技术扩增杂交瘤细胞内的特异免疫球蛋白重链可变区基因片段。方法 用 10 %甲醛溶液固定杂交瘤细胞 ,以NP 40渗透化处理细胞后做逆转录PCR。结果 获得了大约 3 5 0bp的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段 ,与用同一对引物得到的常规逆转录PCR扩增产物一致。结论 此方法操作简便 ,效率高 ,可用于获得特定结构基因片段 。

单向聚合酶链式反应扩增法研究

:c DNA的末端快速扩增 (RACE)是获得全长 c DNA的有效手段之一。本文论述了 RACE技术的原理、方法和改进 ,并介绍了新型 RACE技术。

逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性

目的探讨胎盘多药赖药(MDR3)基因与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)胎盘胆汁酸排泌的相关性。方法收集妊娠晚期ICP患者(ICP组)和正常晚孕妇女(对照组)各30例,分别采集母体静脉血和新生儿脐静脉血及胎盘组织,采用放射免疫分析方法检测母血及脐血中的甘胆酸(CG)含量;采用逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定两组胎盘组织中多药赖药基因mRNA的相对表达量。结果 (1)ICP组母血、脐血中CG水平均高于对照组(28.86±8.51vs2.70±2.19;19.97±8.80vs5.83±5.06μg/ml),以上差异均有统计学意义(P<0.001);ICP组母血CG含量高于脐血中的含量,两者之间存在正相关(r=0.588);对照组脐血CG含量高于母血中的含量,两者之间无直线关系(r=0.212)。(2)两组胎盘组织中均检测到MDR3基因的mRNA,与对照组相比,ICP组胎盘组织中MDR3基因的mRNA水平下降(3.33±1.03vs6.85±1.26),差异有统计学意义(P<0.001);且MDR3-mRNA相对量与脐血甘胆酸和母血甘胆酸水平呈负相关性(r=-0.627;r=-0.795)。结论 MDR3基因可能参与了胎盘胆汁酸的排泌。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

聚合酶链反应法扩增大鼠肾素基因第一内含子中串联重复序列

哺乳类细胞基因组中存在可变的串联重复序列(Variable number of tandem repe-at,VNTR),在不少情况下,因其串联的重复序列数目不同而形成的长度差异与某些疾病的发生发展具有一定的关联。我们在研究大鼠肾素基因第一内含子中一个串联重复序列长度的改变与发生高血压的关系时。

五引物单管聚合酶链反应（PCR）扩增法快速测定人CYP2D610等位基因的类型

以人CYP2D6 10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配 碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6 10等位基因 的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快 速,结果准确。