双效逆转录载体的构建和受控自杀基因在乳腺癌细胞中表达的研究

目的 构建含有Tet On基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组逆病毒载体 ,研究其在乳腺癌细胞中HSVtk基因的受控表达。方法 用PCR方法扩增Tet On基因 ,将其插入 pRevTRE/HSVtk ,形成重组载体pRevTRE/HSVtk/Tet On。用脂质体介导法将 pRevTRE/HSVtk/Tet On导入乳腺癌细胞株 (MCF 7)。经过HygromycinB筛选建立了一株稳定的受四环素衍生物强力霉素 (Doxcycline,Dox)调控表达HSVtk基因的乳腺癌细胞株MCF/TRE/HSVtk/Tet On。用RT PCR的方法检测不同Dox浓度下HSVtk基因的表达 ,以MTT法检测不同Dox浓度下Ganciclovir (GCV)对乳腺癌细胞的杀伤作用。结果 成功构建了pRevTRE/HSVtk/Tet On逆病毒载体。筛选出MCF/TRE/HSVtk/Tet On细胞株 ,该细胞能在Dox的诱导下表达HSVtk基因并被GCV杀伤。结论 HSVtk基因产物可以将无毒性的Ganciclovir (GCV)转变成一种有毒的代谢产物 ,杀死乳腺癌细胞。而该基因的表达受到Tet On调控 ,由强力霉素调节HSVtk基因表达。

IL-2基因逆转录载体的构建与B7联合表达的抗肿瘤研究

目的 :IL - 2是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子 ,B7是诱导细胞免疫的共刺激分子 ,联合在肿瘤细胞中表达IL - 2或IL - 2 /B7,诱导机体抗肿瘤免疫应答 ,为IL - 2基因治疗进入临床提供依据 .方法 :利用逆转录载体PLXSN构建了插入IL - 2基因的重组逆转录病毒载体 .将重组逆转录病毒载体引入包装细胞CRIP ,测病毒滴毒为 6× 10 5CFU/mL ,用成熟重组逆转录病毒转染小鼠胰腺癌细胞MPC - 35 ,经G4 18筛选得抗性克隆MPC - 35 1,PCR检测证实目的基因已整合在MPC - 35细胞基因组中 ;引入携带B7基因的腺病毒载体转染MPC - 35 1,经流式细胞仪证实B7基因已在MPC - 35 1中获得表达 ,命名为MPC - 35 2 .结果 :采用ELISA方法检测MPC - 35 1、MPC - 35 2 分泌IL - 2水平分别为 95 5U/mL及 92 5U/mL ,与亲代MPC- 35比较 ,MPC - 35 1体外增长率及形态无明显变化 ;MPC - 35 2 无形态的改变 ,但增长速度减缓 ,流式细胞仪测试显示 :MPC - 35本身不表达MHC -classI类分子 ,MPC - 35 1有ICAM - 1的表达增加 ,MPC - 35 2 有classII和ICAM -I的表达增加 ;小鼠体内移瘤实验表明 :与作为对照的MPC - 35细胞相比 ,MPC - 35 1,MPC - 35 2 在小鼠体内的生长明显受抑制 ,出瘤时间晚 (P <0 0 5 ) ,瘤块小 (P <0 0 1) ,生命时间延长

不同逆转录载体系统应用于水牛胎儿成纤维细胞转基因的探索

采用2种不同的逆转录病毒载体系统(pMX和pMSCV),构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组载体,探索能高效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)的病毒系统和感染方法.结果发现,2种逆转录病毒系统包装出的重组病毒滴度都能达到106,将pMX病毒系统生产的重组病毒经超速离心浓缩后,滴度可达到107;2种重组病毒都能感染BFFs,但pMX系统比pMSCV系统更能有效地感染BFFs;通过对病毒的感染方式进行比较,发现使用新鲜病毒连续感染BFFs 2次(每次间隔12 h),或者经过超速离心浓缩后的病毒感染BFFs 1次,可以显著提高感染效率.

CHO细胞MAR片段的克隆及其逆转录载体的构建

目的构建重组人促红素(CHO)细胞核基质结合区MAR的逆转录载体。方法以CHO细胞DNA为模板,采用PCR扩增CHO细胞的MAR序列,克隆入逆转录表达载体PLXSN-CAT中,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCR扩增的特异性片段长度为476 bp,以此构建的重组质粒PLXSN-CAT-MAR经BamHⅠ酶切后显示为5.9 kb和476 bp左右的两条片段,测序结果与Gen-bank中的CHO细胞MAR基因(Genbank序列号M62716)序列一致。结论成功构建了CHO细胞MAR片段PLXSN-CAT-MAR重组逆转录表达载体。

γ-逆转录病毒载体包装及浓缩方法对比研究

为选择合适的包装条件与安全高效的浓缩方法生产用于CAR-T制备的γ-逆转录病毒载体,使用两种包装条件γ-逆转录病毒表达载体(pMIG与pMIGⅡ)和包装质粒总量(20μg与40μg)分别生产逆转录病毒载体,利用流式细胞术检测不同条件下生产的病毒滴度;使用超速离心与超滤离心两种浓缩方法得到逆转录病毒浓缩液,运用流式细胞术,检测两种病毒浓缩液滴度及其对T细胞的转导效率,并监测CAR-T细胞增殖与存活率。数据显示,pMIGⅡ载体包装病毒滴度较高(p<0.05),20μg与40μg质粒总量对病毒滴度无显著影响(p>0.05),超滤离心法与超速离心法浓缩后逆转录病毒滴度无显著差异(p>0.05)。研究表明,pMIGⅡ载体与20μg质粒总量更适合包装γ-逆转录病毒,超滤离心法可用于实验室小规模浓缩逆转录病毒,满足CAR-T研究的需要。

勘误:EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

因本文作者失误,发表在《细胞与分子免疫学杂志》2009年第25卷第11期第1013-1015页的“EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定”论文中,图2A及图3用错了荧光显微镜和流式细胞术的图像。

逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

目的 研究HPV16E7(humanpapillomavirus 16E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞 ,检测HPV16E7基因的整合与表达 ,并用生长曲线、血清依赖试验 ,电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察 ,了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出了能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆 ,已传代 5 0代 ,PCR及RT PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录 ,转化细胞的生长速度要高于正常软骨细胞 ,二者都对血清有较大程度的依赖 ,转化细胞的核质比大 ,核仁明显 ,S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强 ,可连续传代达 5 0代。

靶向表达的逆转录病毒载体LN.ALBTRS.TK的构建

目的:构建出在肝细胞中具靶向表达潜能的逆转录 TK 基因载体。方法:用 p2335A-1中的一段2.0Kb的人白蛋白组织特异性转录调节序列(ALBTRS)取代 pSTK 中的 SV40启动子,所构建的载体命名为 LN.ALB-TRS.TK。结果:载体 LN.ALBTRS.TK 的结构中,含有 ALBTRS 启动子,具有在肝细胞中特异表达白蛋白的潜能,载体经酶切鉴定表明结构符合要求。结论:成功地构建出具靶向表达潜能的逆转录载体 LN.ALBTRS.TK。

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。

人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达

目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。

增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达

逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。

含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

含ＣＤ基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建崔龙，曹广文，王元和，屠岳，孟荣贵，高军，仇小芳，吴宗娣，谢苏庆关键词大肠癌；胞嘧啶脱氨酶基因；逆转录病毒载体；癌胚抗原；转录调控序列胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）是真菌及某些大肠杆菌等ＤＮＡ嘧啶补救合成途径中的关...

绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达

目的 实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法 构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果 转染细胞于 48h后 ,在荧光显微镜蓝光激发波长下 ,可发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～5 0 %。感染靶细胞内GFP的有效表达可维持 2个月。结论 构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,可作为组织工程化细胞标记 ,用于细胞动态研究 ,其方法简便、灵敏。

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。

核骨架基质结合区(S/MAR)提高逆转录病毒载体介导egfp在NIH3T3细胞中的表达

为减轻逆转录病毒介导的外源基因的沉默 ,进一步提高逆转录病毒MFG载体介导的转移基因的表达 ,将人 β INF基因上游 80 0bp的核骨架基质结合区 (S MAR)分别反向和正向克隆至MFG载体 3′LTR上游 ,以egfp为报告基因观察S MAR对egfp基因表达水平以及对病毒滴度的影响 .结果显示 :反向和正向的S MAR在瞬时表达的情况都不能提高egfp的表达 ,但在稳定整合的情况下反向S MAR可明显提高egfp在NIH3T3细胞内的表达 ,而正向的S MAR作用不明显 ,另外反向S MAR可明显提高MFG逆转录病毒载体的滴度约 5倍 ;因此改造后的MFG逆转录病毒载体将能更好地用来介导外源治疗基因的表达 .同时还观察到 ,同一个载体骨架在稳定表达的情况下 ,磷酸钙介导较逆转录病毒载体介导的表达水平高 .

大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立

目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、ClaⅠ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK。然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定。结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系。成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系。

白细胞介素-18逆转录病毒载体的构建及抗乙型肝炎病毒的研究

研究鼠白细胞介素 18(IL 18)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用。以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术从受植物凝血素(PHA)和脂多糖 (LPS)刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL 18的cDNA ,并构建表达IL 18基因的重组逆转录病毒载体pLXSN IL 18,转染PA317细胞 ,以逆转录巢式RT PCR方法 ,验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中IL 18的表达 ,将假病毒颗粒感染 2 .2 .15细胞 ,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBVDNA。成功克隆出 5 80bp的小鼠IL 18全基因并构建逆转录病毒载体 ,在转染PA317细胞的上清中检测出含IL 18假病毒颗粒 ,上清感染 2 .2 .15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到14天时HBsAg已变为阴性 ,对HBVDNA有明显抑制作用。IL 18能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg。

人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用

利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包装，病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10^6CFU／m1)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后．分泌G-CSF达168U／m1．Southern分析表明hG-CSF基因己整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中，Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在ENIH3T3-G-CSF细胞的表达。NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内．能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。