多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

逆转录聚合酶链反应与常规法检测蚊体内黄病毒的比较研究

目的：检测比较蚊体内的黄病毒。方法：采用RT－PCR技术及常规的C6／36细胞培养结合免疫荧光法。结果：无论实验感染的登革热病毒蚊虫标本，还是从野外捕捉的标本，均表明RT－PCR检出黄病毒的阳性率比常规法高，且快速、敏捷，操作简便；常规法检出周期长（2～3周），操作复杂、繁琐和反复多次，检出率低。但常规法能通过细胞病变，观察病毒的毒力，这是RT－PCR所不及的。结论：以RT－PCR结合常规法进行虫媒病毒的研究，将更有利于探索蚊虫与虫媒病毒的关系和内在规律。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

逆转录聚合酶链反应检测鼻息肉环氧合酶-2mRNA表达

目的检测研究环氧合酶-2(cyclooxygenase-,COX-2)mRNA在鼻息肉组织中的表达水平,深入认识鼻息肉炎性发病机制。方法利用逆转录-聚合链反应(RT-PCR反应)检测35例鼻息肉组织及23例下鼻甲标本的环氧合酶-2的表达。结果鼻息肉组织中COX-2mRNA表达明显高于下鼻甲正常黏膜。结论鼻息肉组织中COX-2表达明显增高,鼻息肉发病过程中有前列腺素参与。

逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性

目的探讨胎盘多药赖药(MDR3)基因与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)胎盘胆汁酸排泌的相关性。方法收集妊娠晚期ICP患者(ICP组)和正常晚孕妇女(对照组)各30例,分别采集母体静脉血和新生儿脐静脉血及胎盘组织,采用放射免疫分析方法检测母血及脐血中的甘胆酸(CG)含量;采用逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定两组胎盘组织中多药赖药基因mRNA的相对表达量。结果 (1)ICP组母血、脐血中CG水平均高于对照组(28.86±8.51vs2.70±2.19;19.97±8.80vs5.83±5.06μg/ml),以上差异均有统计学意义(P<0.001);ICP组母血CG含量高于脐血中的含量,两者之间存在正相关(r=0.588);对照组脐血CG含量高于母血中的含量,两者之间无直线关系(r=0.212)。(2)两组胎盘组织中均检测到MDR3基因的mRNA,与对照组相比,ICP组胎盘组织中MDR3基因的mRNA水平下降(3.33±1.03vs6.85±1.26),差异有统计学意义(P<0.001);且MDR3-mRNA相对量与脐血甘胆酸和母血甘胆酸水平呈负相关性(r=-0.627;r=-0.795)。结论 MDR3基因可能参与了胎盘胆汁酸的排泌。

用逆转录酶和多聚酶链反应的方法在外周血中检测黑色素瘤细胞

实体肿瘤仅需少量细胞就可引起血源性转移。因现有的方法不够敏感,所以检测有困难。本文作者们用逆转录酶从外周血信息RNA中制造补体DNA,用多聚酶链反应(PCR)来扩大仅在肿瘤组织类型中积极转录的特定基因cDNA。

荧光定量聚合酶链反应法与免疫学化学发光法检测乙型肝炎病毒的比较

目的比较荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法与免疫学化学发光法(CLEIA)检测乙型肝炎病毒(HBV)的价值。方法选择2020年8月—2022年6月上饶市人民医院检验科341份应用FQ-PCR法测定HBV-DNA阳性血清标本作为研究对象,所有血清标本均采用FQ-PCR法及CLEIA检测。分析HBV-DNA阳性标本中乙肝5项[乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗体(HBcAb)、乙肝e抗体(HBeAb)、乙肝e抗原(HBeAg)]阳性检出率在不同血清模式下HBV-DNA载量分布情况,对比HBV-DNA载量于HBeAg阳性与HBeAb阳性中的分布情况。结果HBsAg+、HBcAb+、HBeAg+及HBsAg+、HBcAb+、HBeAb+阳性检出率最高,分别为38.42%、43.70%;HBsAg+、HBsAb+、HBcAb+、HBeAg+阳性检出率为4.99%,HBsAg+、HBsAb+、HBcAb+、HBeAb+阳性检出率为4.69%。另外,HBcAb阳性标本共331份,约占所有HBV-DNA阳性标本数的97.07%。大三阳组(131例)患者HBV-DNA平均载量为5.65×10^(8)U/mL,其中低载量占全组比例为17.56%(23/131)、中载量占全组比例为17.56%(23/131)、高载量占全组比例为64.89%(85/131);小三阳组(149例)患者HBV-DNA平均载量为1.82×10^(6)U/mL,其中低载量占全组比例为81.88%(122/149)、中载量占全组比例为15.44%(23/149)、高载量占全组比例为2.68%(4/149)。HBeAg阳性患者于高载量HBV-DNA中占比为60.67%,HBeAb阳性患者于低载量HBV-DNA中占比为77.71%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论2种方法联合检测在判断HBV感染中具有较高的应用价值,可为诊断及治疗方案制定等提供可靠的参考依据。

聚合酶链反应检验法在细菌性阴道炎诊断中的价值

目的探讨聚合酶链反应(PCR)检验法在细菌性阴道炎诊断中的价值。方法选取2022年8月至2023年3月在商河县人民医院进行检查的80例疑似细菌性阴道炎患者,收集阴道分泌物,均采用细菌培养法和PCR检验。以临床综合诊断作为金标准,比较两种检验方法的诊断效能。结果临床综合诊断显示,阳性72例,阴性8例。PCR检验法的灵敏度、特异度、准确度及阴性预测值均高于细菌培养法(P<0.05)。两种检验方法的阳性预测值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PCR检验法在细菌性阴道炎诊断中的价值较高,值得临床推广应用。

荧光聚合酶链反应–毛细管电泳法与Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶基因启动子突变状态对比分析

目的对比分析荧光聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)法及Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因启动子突变的敏感度、特异度及一致性,为临床检测提供方法学依据。方法收集2017年11月至2019年11月首都医科大学宣武医院265例胶质瘤标本及临床病理资料,分别采用Sanger测序法与荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变。结果TERT基因启动子突变与年龄、组织学分型和WHO分级均显著相关(P<0.05)。Sanger测序法与荧光PCR-CE法的TERT基因启动子突变检出率分别为52.8%(140/265)及51.3%(136/265),敏感度和特异度分别为96.4%和99.2%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.955)。Sanger测序法检出TERT C228T突变103例(38.9%),荧光PCR-CE法检出99例(37.4%),敏感度和特异度分别为95.2%和99.4%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.952)。Sanger测序法和荧光PCR-CE法均检测出TERT C250T突变37例(14.0%),符合率为100.0%,具有较高一致性(Kappa=1.000)。结论荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变率与Sanger测序法相当,敏感度、特异度及一致性均较高,且操作相对简便快速。

多重聚合酶链反应-毛细管电泳-激光诱导荧光法检测三种食源性致病菌

建立了食品中常见致病菌大肠杆菌O157：H7的uidA基因、沙门菌的invA基因和志贺菌的ipaH基因的多重聚合酶链反应（PCR）产物的毛细管电泳快速检测方法。根据这3种致病菌的特异性基因序列设计多重PCR引物,优化PCR扩增反应体系,采用7.0g/L甲基纤维素为筛分介质,毛细管电泳-激光诱导荧光检测法同时检测了3种常见致病菌的PCR扩增产物。在优化的多重PCR反应和毛细管筛分电泳条件下,该方法可以同时检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7基因的多重PCR扩增产物,22min内即可完成3种常见致病菌的毛细管电泳检测。迁移时间的相对标准偏差为1.47%-2.07%。与凝胶电泳法比较,该法简便快速,灵敏度高,可用于多种致病菌脱氧核糖核酸的检测,为食品安全提供了一种可靠的快速检测方法。

AML患者端粒酶逆转录酶mRNA的表达与端粒酶活性的检测

目的:建立一种实时荧光RT-PCR方法,定量检测急性髓细胞白血病(AML)患者外周血单个核细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达水平,观察其与AML发生及复发的关系,探讨hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性的相关关系。方法:采用实时荧光RT-PCR与Lightcycler荧光PCR仪定量检测hTERT mRNA的表达水平,采用PCR-ELISA检测端粒酶活性。结果:①AML首治患者、复发患者、完全缓解期患者以及健康体检者NhTERT分别为299.2±292.8、550.1±441.3、14.0±9.2和12.3±6.7,与健康体检者和完全缓解期患者比较,AML首治患者、复发患者hTERT mRNA表达水平显著升高,而且AML复发患者hTERT mRNA的表达水平显著高于首治患者;②AML首治患者、AML复发患者、AML完全缓解期患者以及健康体检者端粒酶的活性分别为32.8%±24.3%4、8.6%±31.4%、7.4%±5.1%和7.6%±3.6%,AML首治患者、复发患者端粒酶活性显著升高,而且AML复发患者端粒酶活性显著高于首治患者;③hTERT mRNA表达水平与端粒酶的活性呈现良好的相关性,相关系数为0.78。结论:hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性的上调是AML发生与复发的一个重要因素,且hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性呈良好的正相关。

应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒

目的比较实时荧光聚合酶链反应(PCR)与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)2种人乳头瘤病毒(HPV)检测方法。方法采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV,对结果不一致的标本进行测序分析。结果实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好,总符合率为77%,总一致性指数(Kappa指数)为0.538。其中,高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组二者的符合率为82%,Kappa指数为0.410,一致性比其他组好。结论实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好,尤其对于HSIL患者,可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段。

端粒酶和端粒酶逆转录酶在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探讨端粒酶和端粒酶逆转录酶(hTERT)在胃黏膜癌变过程中的作用及其过度表达与胃癌恶性病理生物学行为之间的关系。方法采用聚合酶链反应端粒酶重复序列扩增酶联免疫吸附测定法和免疫组化链菌素亲物蛋白过氧化酶法分别检测端粒酶和TERT在胃癌组织和癌旁非癌组织中的表达,计算阳性细胞的百分率。结果65例胃癌组织中,端粒酶和hTERT蛋白阳性表达率分别为86.2%和81.5%,显著高于相应癌旁非癌组织(P<0.01)。端粒酶活性表达与胃癌组织的淋巴结转移及PTNM分期显著相关(P<0.05),hTERT的表达和肿瘤浸润深度、淋巴结转移和PTNM分期显著相关(P<0.05)。结论检测端粒酶和hTERT可以帮助判断胃癌的发生、浸润、转移和临床分期。

荧光定量聚合酶链反应与分支链DNA信号扩增法检测血清HBV DNA的比较

目的 了解荧光定量聚合酶链反应 (PCR)法与分支链DNA信号扩增 (bDNA)法在检测血清中HBVDNA含量上的优缺点。方法 分别用这两种方法平行检测 44份乙型肝炎患者的血清标本 ,并与定性PCR检测结果比较。同时用荧光定量PCR法观察 15例乙肝患者干扰素治疗期间HBVDNA含量变化。结果 ①荧光定量PCR法和bDNA法比较 ,○a前者测出的HBVDNA含量均值为 ( 3 5 0× 10 5± 3 3 6)copies/μl ;后者为 ( 3 0 7× 10 5± 12 9)copies/μl ,两者比较差异无显著性 (P >0 0 5 )。○b前者的HBVDNA阳性率 79 5 % ;后者及常规PCR定性法均为 5 9 1%。荧光定量PCR法的阳性检出率显著高于bDNA法及常规定性PCR法 (P <0 0 5 )。② 15例中 5例获完全应答的乙型肝炎患者其血清HBVDNA含量在治疗 16周内均逐渐下降至完全转阴。结论 荧光定量PCR法与bDNA法在检测血清HBVDNA含量上 ,结果大多一致 ,且敏感性强 ,检验也较简便、价廉 ,并能较好评价和检测乙肝患者抗病毒疗效 ,宜于临床推广。

Oct-4和人端粒酶逆转录酶在不同胎龄人胚原始生殖细胞的表达变化

目的检测不同胎龄人胚原始生殖细胞中Oct-4、人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达变化。方法取人胚胎生殖嵴,通过RT-PCR检测5-13周龄人胚生殖嵴中Oct-4、hTERT的表达变化;同时,取人胚胎生殖嵴,经石蜡切片,HE染色、免疫组织化学染色等技术,观察不同胎龄人胚原始生殖细胞的形态,检测Oct-4、hTERT的表达情况。结果胎龄6-7周时,生殖嵴中可见少量原始生殖细胞,且表达Oct-4及hTERT;胎龄8~12周时,生殖嵴中原始生殖细胞数量增多,Oct-4及hTERT表达增强（P〈0.05）;胎龄13周以后,生殖嵴中Oct-4阳性的原始生殖细胞数量逐渐减少,Oct-4表达减弱,但hTERT仍然高表达。结论不同胎龄人胚原始生殖细胞中Oct-4的表达呈动态变化,胎龄8-12周时表达较强,但hTERT的表达量始终维持在较高水平,没有明显变化。

结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶mRNA和MUC1 mRNA的检测及其临床意义

背景:传统影像学检查和血清肿瘤标记物检测对结直肠癌微转移的诊断价值有限。目的:检测结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA和MUC1 mRNA表达,探讨两者对结直肠癌微转移的诊断价值。方法:收集53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本,以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达,分析两者表达与肿瘤临床病理特征的关系。应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测对结直肠癌的诊断价值。结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达率和表达水平显著高于正常对照组(P<0.05),两者表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(P<0.05)。hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积分别为0.806、0.778和0.861,诊断界值为Ct<32。结论:外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物,以实时荧光定量RT-PCR联合检测两项指标优于单项检测。

实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物.