逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

用逆转录-聚合酶链反应检测乳腺癌患者骨髓微转移30例报道

目的 :通过分子生物学技术检测乳腺癌患者的微转移灶。方法 :患者常规行乳癌根治术 ,在完成皮瓣游离后 ,于胸骨柄处行骨穿 ,吸取骨髓 3～ 4ml,所采骨髓行RT -PCR检测其细胞角蛋白 19(KT19)含量。切除标本常规送病理。结果 :30例患者临床病理汇报同侧腋窝淋巴结转移阳性 17例 ,胸骨骨髓KT19阳性 7性 ,占4 1.12 % ,其中 3例肿块直径≥ 5 .0cm ,位于内乳内 ,临床未触及锁骨上淋巴结肿大 ;同侧腋窝淋巴结转移阴性13例 ,胸骨骨髓KT19阳性 3例 ,占 2 3.0 7%。总阳性率 33.33%。结论 :在术中游离皮瓣后于胸骨柄处进行骨穿获取骨髓 ,并转应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)检测细胞角蛋白 19(KT19)在胸骨骨髓中的表达 ,可以早期诊断乳腺癌的微转移。

利用逆转录酶的聚合酶链式反应检测外周血中的肿瘤细胞

本文就RT-PCR技术检测外周血中肿瘤细胞的基本原理及其在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等检测中的应用加以综述。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

Oct-4和人端粒酶逆转录酶在不同胎龄人胚原始生殖细胞的表达变化

目的检测不同胎龄人胚原始生殖细胞中Oct-4、人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达变化。方法取人胚胎生殖嵴,通过RT-PCR检测5-13周龄人胚生殖嵴中Oct-4、hTERT的表达变化;同时,取人胚胎生殖嵴,经石蜡切片,HE染色、免疫组织化学染色等技术,观察不同胎龄人胚原始生殖细胞的形态,检测Oct-4、hTERT的表达情况。结果胎龄6-7周时,生殖嵴中可见少量原始生殖细胞,且表达Oct-4及hTERT;胎龄8~12周时,生殖嵴中原始生殖细胞数量增多,Oct-4及hTERT表达增强（P〈0.05）;胎龄13周以后,生殖嵴中Oct-4阳性的原始生殖细胞数量逐渐减少,Oct-4表达减弱,但hTERT仍然高表达。结论不同胎龄人胚原始生殖细胞中Oct-4的表达呈动态变化,胎龄8-12周时表达较强,但hTERT的表达量始终维持在较高水平,没有明显变化。

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型毒株的基因序列设计了一对特异性引物P1/P2,扩增的片段为550bp,根据欧洲型毒株设计了一对特异性检测引物P3/P4,扩增的片段为433bp,建立PRRSV的RT-PCR的检测与血清型鉴别方法。特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA。敏感性试验表明,这2对引物可以分别到检测10-5TCID50和10-4TCID50的病毒含量。利用该方法对重庆、四川某些猪场中临床上疑似为PRRS的20份送检组织样品进行检测,只有引物P1/P2能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物;其中有15份样品呈PRRSV阳性结果,阳性率为75%,说明送检的样品感染的PRRSV为美洲型。试验结果表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,是临床上对PRRS进行快速诊断和分子流行病学调查的实用方法。

用反转录-聚合酶链反应检测狐狸感染犬瘟热病毒的研究

应用反转录——聚合酶链反应技术成功地从发病银黑狐的脾脏中扩增出一条特异性的核酸带,为狐狸犬瘟热病的诊断提供了一个特异敏感的方法。

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革 1～ 4型病毒的多重逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革 1～ 4型病毒核酸序列设计多重RT PCR引物 ,并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性 ,随后对PCR反应条件进行优化 ,以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照 ,验证其特异性。并对 2 0 0 3年 30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测 ,阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革 1～ 4型病毒进行扩增 ,分别获得 2 95、2 37、118、347bp片段 ,与设计相符 ;而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带 ,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ,30份疑似患者血标本RT PCR扩增阳性率为 83.3% (2 5 / 30 ) ,其核酸序列与登革 1型病毒柬埔寨株以及中国 1997、1999年流行株GD14 / 97、GD0 5 / 99同源性分别为 97%、97%、98%。结论 实验证明 ,所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革 1～ 4型病毒 ,为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。

梅花鹿牛病毒性腹泻病毒的分离及其RT-PCR鉴定

对梅花鹿的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分离培养及RT—PCR进行了研究。从腹泻鹿粪样中分离到了 与BVDV的C24V标准椿致细胞病变相同规律的BVDV病毒株,经RT—PCR扩增进一步证实其为牛病毒性腹 泻病毒。

十字花科蔬菜芜菁花叶病毒的RT-PCR快速检测

利用RT PCR技术 ,建立了一种简便、快速、准确地检测十字花科蔬菜芜菁花叶病毒的方法。应用该方法 ,不需复杂的提取、纯化病毒RNA过程 ,直接对田间病样简单处理后进行RT PCR检测。通过获得包含该病毒CP基因的cDNA片段 。

RT-PCR技术检测尿液中survivin mRNA对膀胱癌诊断价值的系统评价

背景与目的:Survivin基因逐渐成为肿瘤诊断、判断预后和治疗的靶点。用RT-PCR技术检测尿液中survivin mRNA作为一种无创性手段用于膀胱癌的诊断,国内外相关研究较多,但其结果不一。本研究旨在应用系统评价方法对相关文献进行客观评价,以评估RT-PCR技术检测尿液中survivin mRNA对膀胱癌的诊断价值。方法:以膀胱肿瘤、生存素、逆转录-聚合酶链反应、敏感度、特异度、诊断等为主要检索词检索PubMed、EMBASE、SCI、Cochrane Library、中国生物医学文献数据库(CBM)、中国期刊全文数据库(CJFD)、中文科技期刊数据库(CSJD)、中华医学会数字化期刊等数据库,并结合Google Scholar等搜索引擎全面搜集1997年到2009年4月关于RT-PCR检测尿液survivin mRNA诊断膀胱癌的研究。根据QUADAS(quality assessment of diagnostic accuracy studies)质量评价标准评价纳入文献质量,用Meta-Disc软件对结果指标进行分析。结果:最终纳入26个研究,共2416例。Meta分析结果显示,RT-PCR技术检测尿液中survivin mRNA诊断膀胱癌与病理检查相比准确度指标合并敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及SROC曲线下面积分别为88%、94%、14.56、0.13、0.9736;巢式RT-PCR技术检测的敏感度、特异度及SROC曲线下面积最高,分别为91%、95%、0.9805;普通RT-PCR技术检测的敏感度和特异度次之,分别为87%和94%;定量RT-PCR技术检测的敏感度为80%,特异度为93%。结论:与病理检查相比,RT-PCR技术检测尿液中survivin mRNA诊断膀胱癌有较高的敏感度和特异度,可作为膀胱镜检查的主要辅助手段之一,用于膀胱癌的筛查及术后监测。

RT-PCR快速诊断禽流感

目前,禽流感检测方法较多,但均费时费力,且灵敏度不高。本研究立足于临床实际,选择A型流感病毒核蛋白(NP)基因序列保守区,设计了一对特异性引物,从临床病料中提取RNA,建立了一步法单管逆转录＿聚合酶链反应(RT＿PCR)快速诊断方法,该方法快速、灵敏,为RT＿PCR用于禽流感的临床早期确诊和分子流行病学调查奠定了基础。

RT-PCR检测病媒生物SARS冠状病毒结果初报

目的 调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主 ,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据。方法 巢式RT -PCR技术、荧光定量RT -PCR技术。结果 利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山、江门及恩平等地的 160份鼠肺样品及 15份蜚蠊的体表擦拭子检测结果表明 ,荧光定量RT -PCR未检测到阳性 ,巢式RT -PCR显示来自广州市的 1份蜚蠊体表擦拭子呈可疑阳性。结论 巢式RT -PCR、荧光定量RT -PCR都适合于病媒生物SARS冠状病毒的初步筛选 ,目前未有明显证据显示鼠类及蜚蠊携带和传播SARS冠状病毒 ,仍需作进一步研究。

垂体特异转录因子pit-1在垂体瘤中的表达及意义的实验研究

目的检测垂体特异转录因子pit-1在垂体腺瘤中的表达,研究Pit-1与激素水平、肿瘤侵袭性的关系,以探讨Pit-1在垂体瘤发病机制中的作用。方法根据术前激素水平、临床表现及术后病理诊断确定腺瘤类型,依影像学表现、术中所见及硬膜病检结果判断对肿瘤侵袭性分级,用免疫组化和RT-PCR分别测定Pit-1蛋白和pit-1mRNA的表达。结果Pit-1在GH腺瘤、PRL腺瘤、GH/PRL混合腺瘤中均有表达,与对照组相比,中、高度表达者占此3种腺瘤的78.8%(26/33),无功能腺瘤及ACTH腺瘤中无Pit-1蛋白的表达。pit-1mRNA在全部的GH腺瘤、PRL腺瘤、GH/PRL混合腺瘤和50%(5/10)的无功能腺瘤中有表达,在ACTH腺瘤组中无表达。GH、PRL、GH/PRL混合腺瘤组间pit-1mRNA的表达量差异无显著性,此3组均显著高于无功能腺瘤组(P<0.05)。GH、PRL腺瘤组中pit-1mRNA的表达量与其各自术前的激素水平呈显著正相关。在表达pit-1mRNA的腺瘤中,侵袭性组高于非侵袭性组。结论Pit-1的表达与垂体腺瘤的表型、功能有关,与某些激素(GH、PRL)水平、肿瘤的侵袭性呈正相关,在某些类型(GH、PRL、GH/PRL)的垂体瘤发病机制中起重要作用。

银屑病患者皮损组织中分泌型磷脂酶 A2-ⅡA 表达的研究

目的：试图从分泌型磷脂酶 A2-IIA（sPLA2-IIA）角度研究其表达与银屑病皮损的关系。方法依据 PASI 评分将寻常性银屑病皮损患者30例分为三组，轻度组11例，中度组10例，重度组9例。非银屑病对照组患者28例。免疫组织化学法检测银屑病患者皮损组织切片和对照组 sPLA2-IIA 表达情况，观察银屑病患者 sPLA2-IIA 表达阳性率与 PASI评分关系。结果银屑病皮损患者 sPLA2-IIA 表达阳性率＋-分别为40％，20％和40％。对照组 sPLA2-IIA 仅表达阳性率（＋）为8％，两组比较差异有统计学意义（χ^2＝61.47，P ＜0.01）。重度组 sPLA2-IIA 表达（）阳性率为88.89％，中度组 sPLA2-IIA 表达（）阳性率为40％，轻度组 sPLA2-IIA 表达（）阳性率为0，三组差异有统计学意义（χ^2＝16.3，P＜0.01）。sPLA2-IIA 表达与 PASI 评分呈显著的正相关（rs ＝0.95，P ＜0.01）。结论sPLA2-IIA 的高表达与银屑病皮损的发生有关，提示 sPLA2-IIA 可能是银屑病分子诊断和靶向治疗的靶点。

应用套式RT-PCR方法检测大肠癌患者外周血中的肿瘤细胞

目的 探讨应用套式RTPCR检测大肠癌患者外周血中的肿瘤细胞的可行性及其临床意义。方法 以CK20mRNA为靶基因，应用套式RTPCR方法检测10名健康人，17名非恶性消化系疾病患者，32名大肠癌患者手术前、后3天外周血中的肿瘤细胞。结果 CK20 mRNA在空白对照组中均呈阴性表达。大肠癌患者CK20表达情况为：2名Duke'sA期患者外周血中未检出CK20阳性细胞，15名Duke'sB期患者外周血中CK20mRNA阳性表达4例，10名Duke'sC 患者外周血CK20mRNA阳性表达6例，5名Duke'sD期患者外周血中CK20mRNA阳性表达4例。32名大肠癌患者中，术前CK20mRNA阳性总检出率为43.8%;A、B 期阳性率为23.5%；C、D期阳性率为66.7%。结论 以CK20为靶基因，应用套式RTPCR检测大肠癌患者外周血中的肿瘤细胞是一非损伤性且特异性、敏感性较高的检测方法。它将有助于肿瘤经血液微转移的早期诊断，并将有助于指导辅助化疗和监测其疗效。

RT-PCR检测猪粪便中猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立

通过逆转录-聚合酶链扩增(RT-PCR)反应,建立从猪粪便中检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RNA的方法,以此方法检测了2个猪场8份样本,结果显示6份猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性。