重组酶介导的油菜茎基溃疡病菌荧光核酸扩增检测体系的建立

本文通过重组酶介导的核酸扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)建立一种快速检测油菜茎基溃疡病菌的方法。根据油菜茎基溃疡病菌的特异基因LMR1-D保守序列设计引物和探针,分析建立的RAA方法的灵敏度和特异性。该方法在39℃下,反应时间段(<20 min),检测下限可达10拷贝·mL^(-1),与油菜黑胫病菌等近似种无交叉反应,具有良好的特异性。本研究建立的RAA方法反应速度快、特异性强、灵敏度高,适用于油菜茎基溃疡病菌的快速检测。

乙脑病毒重组酶介导逆转录扩增检测方法的建立

目的建立乙脑病毒重组酶介导逆转录核酸扩增(RT-RAA)快速检测方法。方法根据乙脑病毒NS1基因片段设计引物和探针,通过优化筛选确定最佳引物组合,建立乙脑病毒RT-RAA检测方法,并对其检测灵敏度和特异性进行测试。结果建立的乙脑病毒RT-RAA检测方法灵敏度可达10拷贝,方法检测时间少于20 min,最快2-3 min即可观察到明确荧光扩增信号,与登革病毒、黄热病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒及正常血液样本无交叉反应。结论建立的乙脑病毒RT-RAA检测方法灵敏、快速、特异性好,适用于口岸现场乙脑病毒的快速检测。

用重组酶介导等温核酸扩增技术检测烟曲霉

目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术（RPA）方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化条件为：引物长度：18-30 bp;产物长度：200-700 bp;扩增温度：37-42℃,最低在27℃也可实现扩增;扩增时间：15-40 min,15 min即可达到凝胶电泳可检测的产物量;只需简单的恒温加热设备。RPA和Taq PCR可检测到的最低DNA浓度均为100 ng/m L。RPA仅对烟曲霉有特异性扩增,对黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、中国红酵母均无交叉扩增反应。结论建立的针对烟曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的RPA检测方法,可以快速、特异、灵敏地鉴定和检测烟曲霉。

重组酶扩增技术概述及应用研究进展

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。

人乳头瘤病毒6型和11型通用型含内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术检测方法的建立

目的建立一种通用型含内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术(EIC-RAA)检测人乳头瘤病毒6型(HPV-6)和11型(HPV-11)的方法,以实现HPV-6和HPV-11的简单、准确、快速筛查。方法针对HPV-6和HPV-11的L1片段保守区域设计通用型引物和探针并结合核糖核酸酶P(RNaseP)基因引物和探针作为内参建立了检测HPV-6和HPV-11的EIC-RAA方法;用系列浓度稀释的质粒和不同亚型HPV样本核酸检验其灵敏度、重复性和特异度;收集的230份临床样本进行EIC-RAA和商业化HPV PCR-荧光探针法检测,并对结果进行比较。结果建立的EIC-RAA方法可在39℃条件下30min内实现HPV-6和HPV-11的检测,其灵敏度为10copies/reaction,重复性好,特异度高,EIC-RAA检测结果与商业化HPV PCR-荧光探针法检测结果的符合率为100%。结论建立了一种检测HPV-6和HPV-11的EIC-RAA方法,该检测方法具有简单、准确、快速的优点,在HPV-6和HPV-11的筛查中具有潜在的应用价值。

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCV RNA及与RT-PCR的比较

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT-PCR的灵敏性差异和相关性,以及TMA临床应用的意义。方法:利用鼠白血病反转录酶(moloney murine leukemia virus,MMLV)、T7 RNA聚合酶及2条特异性引物等建立TMA扩增体系;通过HCV RNA的扩增曲线的相关性变化,评价不同储存温度对TMA扩增体系的稳定性和重复性的影响;通过扩增一组10倍梯度稀释的HCV RNA体外转录样本,评价TMA体系与RT-PCR的灵敏性差异。收集101份临床诊断为慢性丙型肝炎患者的血清,同时采用TMA试剂和RT-PCR试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用直线相关和回归探讨两种方法检测血清HCV RNA的相关性。结果:成功地建立了TMA扩增体系,该体系在室温下放置24 h,结果影响较大,但在4℃储存6 d,-20℃下储存6个月内扩增效果不受影响,稳定性良好。与湖南圣湘生物技术公司RT-PCR试剂检测结果的比较显示:31份血清标本TMA及RT-PCR均检测到阳性20例,阴性11例,检测一致率为100%。选取其中20例阳性标本进行定量分析,发现两种技术有很好的相关性(r=0.91,P<0.01)。与上海科华公司的RT-PCR试剂检测结果比较,发现在70份血清标本中,TMA检出RNA阳性标本数为34例,阴性标本数为36例,PCR检出RNA阳性标本数为32例,阴性标本数为38例,检测一致率为97.1%,两种检测方法阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中29例PCR检测和TMA检测均有定量结果的血清进行分析,两种技术也有很好的相关性(r=0.96,P<0.01)。结论:TMA检测试剂在-20℃下储存,6个月内稳定性和重复性良好。TMA与RT-PCR均能很好地检出血清中HCV RNA,两种技术有很好的相关性,定量检测有很好的可比性。

等温核酸扩增技术在病原体检测中的应用

近年来,新型传染病相继爆发,如严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)、H7N9禽流感等,严重威胁着人类健康和社会、经济的可持续发展,同时给传染病的防控带来了严峻挑战。病原体检测是传染病防控的重要环节,越来越多的新技术被应用其中。等温核酸扩增技术作为一种快速、灵敏度高的病原体检测技术,已取得了长足发展。对等温核酸扩增技术的原理、重要特性及其在病原体检测中的应用进展进行了较为全面的综述,以期为这一技术的推广和应用提供重要参考。

甲型流感病毒的逆转录重组酶介导核酸扩增快速检测方法研究

目的利用逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)建立检测甲型流感病毒的快速方法。方法通过使用逆转录酶,将甲流病毒RNA逆转录为cDNA,根据NCBI基因库中甲型流感病毒保守序列设计引物及探针,用cDNA作模板,进行RT-RAA检测甲型流感病毒;构建携带甲型流感病毒的质粒,检测已知样本,分析该方法的灵敏度和特异性。结果采用甲型流感病毒通用型引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而对其他非甲流病毒无交叉反应;RT-RAA反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30min即可得到扩增结果,反应体系中最低扩增拷贝数为100copies。结论建立的RT-RAA检测甲型流感病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于甲型流感病毒通用型的快速检测。

寨卡病毒核酸检测技术研究进展

寨卡病毒(ZIKV)为黄病毒科黄病毒属的一种单链RNA病毒,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,也可通过血液、性、母婴等途径传播。传播ZIKV的蚊虫在我国分布广泛,同时,随着全球化的发展,世界各国人员往来日益频繁,ZIKV在我国有潜在传播的可能性。核酸检测技术是实验室快速检测的有效手段,对预防和控制ZIKV传播具有重要意义。本文介绍了ZIKV基因组结构,并对ZIKV核酸检测的样本特点及方法进展作一综述。

逆转录环介导等温扩增技术检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒（Beanpodmottlevirus，BPMV）可危害大豆、菜豆等豆科植物，造成品质和产量下降。目前，检测BPMV主要采用DAS-ELISA技术及基于RT．PCR的分子生物学方法。近年来开发的环介导等温扩增（100p—mediatedisothermalamplifi—cation，LAMP）是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和1个具有链置换特性的DNA聚合酶（BstDNApolymer-ase），在等温条件下高效扩增靶基因，

恒温荧光扩增法快速检测食品中金黄色葡萄球菌

目的建立恒温荧光扩增法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌.方法基于重组酶介导链替换核酸扩增技术针对金黄色葡萄球菌nuc基因的保守区域设计特异性引物和探针,建立了检测金黄色葡萄球菌的恒温荧光扩增检测方法,并评价其敏感性、特异性、重复性和符合率.结果该方法可在常温(37~42℃)实现核酸快速扩增,20 min即可完成反应;敏感性较高,金黄色葡萄球菌的检出限为9.12×10^(2) CFU/mL;特异性强,与大肠埃希氏菌O157∶H7、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌的核酸均无交叉反应;不同稀释度菌液检测阈值时间的变异系数为5.78%~5.93%,重复性较好;采用该方法与荧光聚合酶链反应方法同时对50份临床样品进行检测,总符合率均为100%,差异不显著(P>0.05).结论本研究建立的金黄色葡萄球菌恒温荧光扩增检测方法具有敏感性高、特异性强、时间短的特点,可用于金黄色葡萄球菌的快速检测.

基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

乙脑病毒实时荧光重组酶介导逆转录扩增方法的建立

目的建立基于逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)快速进行乙脑病毒(JEV)分型鉴定方法。方法根据乙脑病毒NS1基因设计通用型引物和探针,针对E基因分别设计Ⅰ型和Ⅲ型JEV特异性引物和探针,建立JEV RT-RAA检测方法,并分别对其灵敏度、特异性和重复性进行测试。结果建立的方法检测时间短(<20 min),与登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒、寨卡病毒及无交叉反应,检测灵敏度可达100拷贝/μl,JEVⅠ检测体系的灵敏度可达10拷贝/μl;方法的重复性好。结论建立的JEV分型鉴定RT-RAA方法快速、特异、灵敏,适用于口岸现场JEV的快速检测。

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。

基于重组酶介导等温扩增技术的3种棘球绦虫核酸检测方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法分别以多房棘球绦虫(GenBank登录号:NC 000928)、细粒棘球绦虫(GenBank登录号:NC044548)和石渠棘球绦虫(GenBank登录号:NC009460)线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DN A和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果所建立的多重RAA检测方法可在39℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DN A快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测日本血吸虫感染性钉螺

目的建立重组酶介导的核酸等温扩增荧光(Recombinase aided amplification,RAA)法快速检测日本血吸虫感染性钉螺技术,并探索钉螺样品的最佳处理方式。方法将钉螺样本分成3组,每组均含7个亚组,其中6个亚组分别为50只阴性钉螺中混合1、2、3、4、5、10只日本血吸虫感染性钉螺,1个亚组为100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺。3组钉螺分别采用压碎去壳核酸试剂盒提取法、压碎去壳核酸粗提法和直接压碎带壳核酸粗提法进行处理,并分别进行荧光RAA与PCR法检测,对检测结果进行比较。结果建立了荧光RAA检测技术,工作温度为39℃,30 min内即可完成日本血吸虫感染性钉螺检测。钉螺群体样本采用压碎去壳核酸试剂盒提取法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺;采用压碎去壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合3只感染性钉螺;采用直接压碎带壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺,PCR法仅可检测出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺。结论成功建立了钉螺群体样本中日本血吸虫感染性钉螺快速检测的荧光RAA法,该方法具有快速、灵敏、操作简便等特点;压碎去壳核酸粗提法为钉螺样品的最优处理方式。

重组酶介导的蓝氏贾第鞭毛虫特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

目的建立基于重组酶介导的等温扩增技术(RAA)的蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测方法,并评价其检测敏感性和特异性。方法选择蓝氏贾第鞭毛虫β-贾第素(β-giardin)基因作为检测靶基因,设计、合成特异性检测引物及荧光探针,建立荧光RAA检测体系。分别以不同拷贝数的重组质粒(含β-giardin基因靶序列)和不同浓度蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以蓝氏贾第鞭毛虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板进行扩增,评价其检测特异性。结果成功建立了蓝氏贾第鞭毛虫荧光RAA检测方法,其可在等温(39℃)条件下实现对靶基因片段的快速、特异性扩增(20 min内)。分别以重组质粒和蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板,该方法的检测敏感性可达10~2拷贝/μL和1 pg/μL;以日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板的RAA检测结果均为阴性,具备较好特异性。结论建立了一种操作简便、敏感、特异的可用于蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测的荧光RAA方法。

重组酶介导恒温扩增快速检测人鼻病毒的方法学研究

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增技术(reverse transcriptase recombinase aided amplification,RT-RAA)建立检测人鼻病毒的快速方法。方法根据NCBI基因库中人鼻病毒保守序列设计引物及探针,将人鼻病毒RNA反转录为cDNA,然后使用反转录酶,以cDNA作模板,扩增检测人鼻病毒核酸序列。研究采用构建带有人鼻病毒核酸序列的质粒,检测不同浓度的质粒分析该方法的灵敏度,采用已知样本检测方法的特异性。结果设计的人鼻病毒特异性引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而与其他病毒无交叉反应。该反应条件为39℃恒温,扩增结果用时30 min,最低扩增拷贝数为100拷贝。结论建立的RT-RAA检测人鼻病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于人鼻病毒的快速检测。

重组酶介导等温核酸扩增结合核酸试纸条即时检测猪流行性腹泻病毒方法的建立

本文旨在建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(Recombinase aided amplification,RAA)结合核酸试纸条的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可视化检测方法,以应用于养殖场内部实现现场快速检测。选择PEDV N基因保守序列为模板,设计特异性引物及荧光探针,对引物进行对比筛选,对反应条件、引物浓度、探针浓度进行优化,并对其特异性、敏感性和重复性进行评价。将建立的检测方法应用于临床样品,并与荧光定量PCR方法进行比较。结果表明:建立的方法在38℃恒温10 min扩增反应以及5 min侧流向层析后,即可完成检测,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪德尔塔冠状病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒均无交叉反应,最低检测限可达101拷贝/μL。应用该方法检测20份阴性和20份阳性,共40份临床样本,检测结果与荧光定量PCR方法保持一致。本研究建立的RAA结合核酸试纸条的方法具有特异性好、灵敏度高、耗时短、仪器设备简便等优点,适用于基层现场快速检测。