逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲１、甲３和乙型流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的ＨＡ基因的ＨＡ１片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果以流感病毒的ＨＡ基因为模板设计的三对引物，用多重逆转录聚合酶链反应能特异性地扩增出９４２ｂｐ、１１１７ｂｐ和 ７５１ｂｐ的核酸片段，它们分别和甲１、甲３和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感病毒。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。

检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。

逆转录多重巢式聚合酶链反应技术在急性单核系白血病M4/M5MLL基因重排检测中的应用

目的探讨逆转录多重巢式聚合酶链反应(多重PCR)技术在初诊M4/M5患者MLL基因重排检测中的价值。方法采用骨髓直接或短期培养法制备染色体,应用R显带技术进行核型分析。采用多重PCR技术,检测40例初诊M4/M5患者中5种急性髓系白血病常见的MLL融合基因以及MLL部分串联重复。结果R显带揭示7有涉及11q23的易位,包括t(6;11)(q27;q23)、t(9;11)(p21;q23)、t(11;17)(q23;q21)、t(11;19)(q23;p13.1),14例有其他核型异常,19例为正常核型。多重PCR证实了7例核型分析显示11q23易位标本中的6例,例3核型分析揭示46,XX,t(6;11)(q27;q23),多重PCR检测MLL/AF6为阴性;19例显带分析为正常核型标本中检出2例MLL部分串联重复。结论多重PCR是对初诊M4/M5患者进行各种MLL重排筛检的有效方法。

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3 和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的 3对引物能特异性地扩增出 94 2bp、1117bp和 75 1bp的核酸片段 ,它们分别和甲1,甲3 和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0 1TCID50 的样品。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革 1～ 4型病毒的多重逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革 1～ 4型病毒核酸序列设计多重RT PCR引物 ,并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性 ,随后对PCR反应条件进行优化 ,以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照 ,验证其特异性。并对 2 0 0 3年 30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测 ,阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革 1～ 4型病毒进行扩增 ,分别获得 2 95、2 37、118、347bp片段 ,与设计相符 ;而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带 ,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ,30份疑似患者血标本RT PCR扩增阳性率为 83.3% (2 5 / 30 ) ,其核酸序列与登革 1型病毒柬埔寨株以及中国 1997、1999年流行株GD14 / 97、GD0 5 / 99同源性分别为 97%、97%、98%。结论 实验证明 ,所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革 1～ 4型病毒 ,为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。

多重荧光和传统逆转录-聚合酶链反应方法在手足口病监测中的应用研究

目的比较研究多重荧光逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和传统RT-PCR方法对手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)检测结果的影响。方法采集HFMD患儿轻症门诊病例咽拭子标本86份、重症住院病例咽拭子120份,采用多重荧光和传统RT-PCR方法进行检测并比较分析。结果多重荧光RT-PCR较传统RT-PCR对咽拭子标本中肠道病毒(Enterovirus,EV)的检出率有显著提高。轻症病例的检出率由52.3%提高至93.0%,重症病例的检出率由8.3%提高至60.0%。EV 71型、柯萨奇病毒A组16型及其他EV在HFMD病原中的构成比也相应发生了改变。结论在对HFMD咽拭子标本的检测中,尤其是对于重症病例,多重荧光RT-PCR较传统RT-PCR更灵敏,能够更真实地反映HFMD疫情的病原构成。

多重逆转录-聚合酶链反应对甲_1与甲_3型流行性感冒病毒神经氨酸酶亚型的快速鉴定

为建立流行性感冒 (流感 )病毒甲1、甲3 型神经氨酸酶 (NA)N1与N2 亚型的快速鉴别方法 ,通过对大量NA基因序列的比较 ,分别在N1与N2 亚型的保守区域设计特异性引物 ,采用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)进行NA基因扩增 ,并评价了其灵敏度和特异性。结果表明 :MRT PCR能特异性扩增甲1、甲3 型流感病毒NAN1与N2 亚型基因 ,灵敏度为 0 1TCID50 ,可从临床患者含漱液中直接检测到N1、N2 基因。MRT PCR方法不仅可作为甲型流感病毒NA亚型的快速鉴定方法 ,而且可以作为人类甲型流感病毒基因快速诊断方法的补充 ,应用于流感爆发疫情的应急诊断。

应用多重逆转录聚合酶链反应技术检测石蜡包埋三种软组织肉瘤中融合基因的表达

目前，用于软组织肉瘤（soft tissue sarcoma，STS）染色体易位或其融合基因检测的技术方法很多，以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法最为常用。然而对于一些形态学缺乏特征性排列结构的小圆细胞肿瘤，运用RT-PCR技术对不同融合基因逐一检测和排除，也存在检测程序繁琐、耗时、耗材等不足。针对此问题，我们设计了多重引物，应用多重RT-PCR技术检测石蜡包埋STS融合基因的表达，建立一套稳定高效、适合临床常规STS融合基因表达检测的分子诊断方法。

多重逆转录-聚合酶链反应检测麻疹风疹流行性腮腺炎病毒基因的研究

目的 探索麻疹、风疹、流行性腮腺炎 (腮腺炎 )病毒感染的快速诊断方法。方法 利用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)方法对麻疹、风疹、腮腺炎病毒的相关基因检测进行研究。结果 直接从麻疹疫苗沪1 91 株 ,风疹疫苗BRDⅡ株 ,腮腺炎疫苗S79株 ,冻干麻疹、腮腺炎、风疹联合减毒活疫苗及临床麻疹、风疹、腮腺炎患者的标本中 ,同时检测出麻疹、风疹、腮腺炎病毒 6 3 5bp、4 1 1bp、5 1 9bp的特异性核酸片段 ,MRT PCR 1次扩增灵敏度均可分别达到 1TCID50 。结论 该方法能特异、敏感地检测临床标本中麻疹、风疹、腮腺炎病毒 ,是快速诊断麻疹、风疹。

多重逆转录聚合酶链反应方法半定量检测多药耐药基因mRNA表达

目的 建立多重逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法半定量检测肝癌多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法 在对二重RT PCR扩增 5种MDR基因mRNA动力学观察及建立RT PCR标准曲线的基础上 ,建立六重RT PCR方法。结果 六重RT PCR与单重或二重RT PCR扩增体系在特异性和扩增效率等方面相同 ,实验重复性较好。结论 该方法对于检测肝癌组织和肝癌细胞MDR基因mRNA表达具有特异、灵敏、简便、快速 (6h)、所需标本量小 (5mg)及半定量等优点 ,能快速同时分析大量样本 ,具有临床应用前景。

应用多重PCR-RFLP技术检测头发、口腔腭粘膜的ABO基因型

目的 探讨对头发、口腔腭粘膜等组织标本进行ABO基因分型的可行性。方法 应用多重聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (多重PCR RFLP)技术 ,检测 8例头发和 6例口腔腭粘膜标本的ABO基因型 ,标本的基因组DNA经 2对引物同时进行扩增 ,扩增后的产物同时用MspⅠ和KpnⅠ 2种限制酶进行消化 ,通过消化后产生的片段即可判断结果。然后将分析结果与血清学技术检测的ABO表现型和受检者血液标本的基因型进行比较。结果 14例标本共检出 6种ABO基因型 ,与表现型和血液标本的基因型结果完全一致。结论 该方法操作方便 ,重复性、稳定性好 ,可鉴定 15种基因型 ,应用于法医学鉴定具有可行性。

多重RT-PCR MassARRAY技术检测27种呼吸道病原体方法的建立和临床应用评价

目的建立一种可同时检测27种呼吸道病原体的多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)MassARRAY技术,并探讨其临床应用价值。方法针对呼吸道病原体设计扩增引物和延伸引物,并构建病原体标准质粒;按梯度稀释标准质粒,用于考察多重RT-PCR MassARRAY方法的灵敏度、特异性和重复性。分别采用建立的多重RT-PCR MassARRAY方法和实时RT-PCR方法检测207份呼吸道感染患者鼻咽拭子样本,比较2种方法的检测性能。结果建立的多重RT-PCR MassARRAY方法对29种病原体的最低检出限为1×10^(1)~1×10^(3)拷贝/μL,特异性高。207例鼻咽拭子样本中共检出57份阳性,阳性检出率为27.54%。细菌性病原体中检出率较高的是肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体和流感嗜血杆菌;病毒性病原体阳性检出率较高的为副流感病毒、人偏肺病毒和甲型流感病毒。2种方法检测结果总符合率为99.03%,具有高度的一致性(kappa=0.98)。结论基于RT-PCR MassARRAY技术的27种呼吸道病原体检测方法具有较高的灵敏度和特异性,且操作简单,通量高,可以为临床呼吸道病原体感染的诊断提供实验室依据。

用逆转录聚合酶链反应方法检测SARS冠状病毒

目的 应用双位点逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)和改良巢式实时RT PCR方法检测临床标本中SARS冠状病毒(SARS CoV)核酸,以提高检测的可靠性和灵敏度。方法 对 2003年杭州市 3例严重急性呼吸综合征(SARS)临床确诊患者、4例疑似和 27名医学观察者的咽拭子标本用巢式实时RT-PCR检测SARS- CoV核酸,对阳性扩增产物进行核酸序列测定,同时对 3例患者的标本应用半巢式RT -PCR检测另一位点SARS- CoV核酸片段,并应用常规实时RT- PCR技术及改良实时RT -PCR技术进行检测。结果 3例患者的巢式RT -PCR检测结果 2例阳性, 4例疑似和 27名医学观察者均为阴性;阳性扩增产物的核酸序列与SARS- CoV基因组相应部分序列完全一致。3例患者标本的另一位点的半巢式RT -PCR及实时RT PCR结果均相同。在检测低拷贝数标本时,常规实时RT- PCR技术在约 35个循环后出现弱阳性信号,但改良的巢式实时RT -PCR技术可使强阳性信号在 10个扩增循环后出现。结论 双位点RT- PCR方法是提高检测准确性的有效方法,改良巢式实时RT- PCR技术较常规实时RT- PCR技术具有更高的灵敏度。

应用ntPCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异

目的建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异及rtA181V变异的快速检测方法。方法根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株rt236N PCR产物中含有DraⅠ酶切位点(5'-TTTAAA-3'),而变异株rt236T无此限制性酶切位点;使野生株rt181A PCR产物中含有BlpⅠ酶切位点(5'-GCTNAGC-3'),而变异株rt181V无此限制性酶切位点。选取4份应用ADV治疗1年以上出现HBV DNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清,经PCR扩增、限制性内切酶酶切及凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各1例进行HBV RT区基因序列分析。结果建立的ntPCR-RFLP方法可以检测到102copies/L的HBV DNA;RFLP分析结果与DNA测序结果一致,4份血清标本中检测到1份rtN236T变异,2份rtA181V变异。结论应用ntPCR-RFLP方法检测HBV阿德福韦耐药变异具有灵敏、特异、简便的优点,适用于HBV耐药变异的监测。

靶序列富集多重PCR-液相芯片联合检测4种常见呼吸道病毒的初步应用

目的呼吸道病毒是引起婴幼儿呼吸道感染的最主要病原体,为快速准确诊断其感染,文中建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法采集南京总医院儿科就诊的有急性呼吸道感染症状的患儿咽拭子标本120例及30例正常对照标本,分别纳入患儿组和对照组。针对A型流感病毒(Flu A)、B型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)和B型(RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和Luminex液相芯片(x MAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了特异性、灵敏度评价。收集以急性上呼吸道感染为主要表现的患儿咽拭子标本,用上述建立的方法进行检测分析,分别与单病毒基因荧光定量PCR检测方法及x TAG液相芯片法进行比对检测。结果建立了Flu A、Flu B、RSVA和RSVB4种呼吸道病毒的特异性快速分子检测方法且灵敏度可达10拷贝/μL。用快速分子检测方法和单病毒基因荧光定量PCR法对120例疑似患儿咽拭子标本进行检测,快速法阳性检出率为31.7%(38/120),荧光定量法阳性检出率为29.2%(35/120)。经一致性检验分析提示2种方法一致性较强(k>0.7)。部分标本同时采用x TAG液相芯片试剂盒进行检测,经一致性检验分析提示2种方法一致性较好(k>0.6)。结论临床的初步应用证实了4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法具备灵敏、特异、快速等优点,为临床早期、准确判断呼吸道感染的病原体提供实验依据。

环氧合酶-2在卵巢癌组织中的表达

目的:探讨环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在卵巢癌组织中的表达及意义。方法:应用免疫组化和RT-PCR技术检测正常卵巢和卵巢癌组织中COX-2的表达情况。结果:检测的38例卵巢癌组织COX-2蛋白表达阳性23例,阳性表达率61%,33例表达COX-2mRNA,阳性表达率为87%;20例正常卵巢组织COX-2蛋白与COX-2mRNA均呈阴性表达。结论:COX-2在卵巢癌组织高表达,并在其发生发展中起重要作用。

兔角膜缘干细胞标志物α-烯醇化酶的表达与增龄的关系

目的了解角膜缘干细胞标志物α-烯醇化酶表达随着增龄的变化情况。方法选取新西兰白兔3月龄(青年组)、18月龄(中年组)和36月龄(老年组)各10只的角膜上皮组织,DMEM/F12培养液培养角膜缘干细胞。半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测α-烯醇化酶mRNA含量。结果α-烯醇化酶mRNA含量均数青年组为1.49,中年组1.33,老年组0.92,三组比较差异有统计学意义(F=289.981,P<0.01)。α-烯醇化酶mRNA月平均下降速度均数中年组为0.010,老年组0.023,两组比较差异有统计学意义(t=-7.860,P<0.01)。结论随着增龄,角膜缘干细胞α-烯醇化酶mRNA含量逐渐降低,α-烯醇化酶mRNA月平均下降速度表现为一个非线性的过程。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因诊断方法的建立

目的建立有效可行的高通量葡萄糖．6一磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD）基因诊断新技术。方法建立单管三重PCR扩增G6PD基因外显子2—13目的片段，构建双管25重SNaPshot反应体系检测25个已报道的中国人群的G6PD基因突变位点。用20份已知基因型的样品进行重复性试验。对60例未知样品同时用多重SNaPshot基因分型技术和DNA测序法进行双盲试验。结果建立的多重SNaPshot技术可同时检测25个G6PD基因突变位点，且可区分正常、女性杂合子与男性半合子／女性纯合子，有效检出复合突变。批内及批间的重复性均达到100％。60例未知样本检出23例突变，SNaPshot基因分型结果与测序结果完全一致，特异性和准确性均为100％。结论建立的单管三重PCR结合双管25重SNaP—shot技术是一种有效可行的G6PD缺乏症基因诊断的新方法。