逆转录—巢式PCR法分析胃癌活检组织CD44拼接变异体

目的 改进CD44基因异常表达检测方法，探讨该方法对胃癌早期诊断、转移监测的意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)结合巢式PCR(Nested PCR)技术，检测了89例胃镜活检标本，其中70例胃癌、19例癌前病变(11例非典型性增生、8例肠上皮化生)及其相应的病变旁正常组织活检标本CD44v(CD44拼接变异体)以及CD44v8—10(CD44外显子8—10拼接变异体)的表达。并对巢式PCR产物测序验证其可靠性。结果 建立了逆转录巢式PCR检测胃镜活检标本CD44异常拼接变异体方法。对巢式PCR产物测序证实符合相应的CD44核苷酸序列，结果可靠且更为简便。全部标本均有CD44s(CD44标准型)的表达。胃癌组织CD44v表达阳性率88．6％(62／70)，其中CD44v8—10阳性率72．9％(51／70)。癌前病变组织CD44v表达阳性率为81．8％(非典型性增生9／11)和37．5％(肠上皮化生3／8)，CD44v8—10阳性率在非典型性增生为72．7％(8／11)。病变旁正常组织CD44v阳性率16．9％(15／89)，其中CD44v8-10阳性率13．5％(12／89)。胃癌和非典型性增生组显著高于正常组。本研究对35例在我院行手术治疗的CD44v阳性患者进行了追踪，有2例胃癌患者第1次胃镜检查为非典型性增生，CD44v强阳性表达。分别在第二、三个月后再次行胃镜检查确诊为胃癌。结论 RT—巢式PCR方法灵敏度高、特异性好，应用此法检测CD44v及CD44v8—10在胃癌及非典型性增生活检组织中呈现高表达，可作为胃癌诊断和判断预后的标志之一。

阿胶的半巢式-多重PCR鉴别方法研究

采用半巢式-多重PCR(聚合酶链式反应)法鉴别阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分。首先采用液氮研磨法从阿胶中提取高质量的DNA(脱氧核糖核酸),以通用引物P1和P2进行第一轮扩增,并将扩增产物作为第二轮PCR的模板;再以包含通用引物P1和4种物种(驴、马、猪和牛)特异性引物A、B、C和D的混合引物进行第二轮多重PCR扩增;最后电泳检测第二轮扩增产物,根据电泳条带的分子量大小,判断阿胶产品的动物原材料是否掺假。结果表明,采用本方法可观察到不同动物DNA分子量之间的明显差异,通过DNA电泳结果直接判断阿胶产品中是否掺假。

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。

猴泡沫病毒(SFV)RT-nestedPCR检测方法的建立及初步应用

目的建立实验猴群及相关生物制品猴泡沫病毒(SFV)的PCR检测方法。方法选择SFV-1、SFV-3、SFVCPZ前病毒序列的pol基因同源性较高的区域设计嵌套引物对SFV-1毒种进行RT-nestedPCR扩增并克隆测序,以确定其准确性,通过验证方法的特异性和敏感性,初步应用该方法对恒河猴外周血淋巴细胞(PBLs),常用猴肾传代细胞及猴源性生物制品进行检测。结果经RT-nestedPCR扩增出的片断与SFV-1 cDNA序列同源性达到99%,对10只恒河猴的检测结果为5只阳性,5只阴性,对常用猴肾传代细胞及脊髓灰质炎疫苗的检测结果均为阴性。结论所建立的SFV RT-nestedPCR检测方法能准确的检测出恒河猴SFV的感染情况,对控制实验猴群的质量具有重要意义。该方法可用于检测猴源性生物制品中SFV的污染情况,为保证生物制品应用的安全性提供一定依据。

蓝莓组织RNA提取方法的研究

为建立蓝莓组织RNA提取方法,以蓝莓幼果为材料,比较了5种RNA提取方法,建立了改良的十六烷基三甲基溴化铵-乙酸钾(CTAB-KAc)提取方法,并比较了CTAB-KAc法对蓝莓根、成熟叶、幼茎、花、幼果和成熟果实组织RNA的提取效果.结果表明:CTAB-KAc法提取RNA的过程只需3 h,蓝莓幼果RNA的A260/A280和A260/A230值分别达到2.02和2.46,且无基因组DNA污染,RNA产量达到143.37μg·g-1;用CTAB-KAc法成功提取了蓝莓成熟叶、幼茎、花、幼果和成熟果实组织的RNA,但是根的RNA提取方法还需优化.把上述RNA反转录成c DNA后进行PCR,扩增出预期大小的目的片段,可满足后续分子生物学实验的要求.

两种浓缩方法在水样脊髓灰质病毒检测中的应用

水样中病毒颗粒的有效浓缩和富集是病毒检测的首要任务.分别应用氯化钠-氯化铝沉淀法和滤膜吸附法,对模拟水样和实际水样的脊髓灰质病毒进行浓缩分离.经过核酸提取后,通过RT-nest-PCR分子生物学技术扩增特异性核酸片段检测病毒,结果发现,两种浓缩方法对水样中的脊髓灰质病毒都能有效地回收富集及检测.通过计算,分别检测到污水处理厂进水口中病毒存在所用水样的有效体积,氯化钠-氯化铝沉淀法为3.5 mL,滤膜吸附法为2.1 mL.应用氯化钠-氯化铝沉淀法对另外3个污水处理厂水样的病毒检测发现,进水口和出水口均有脊髓灰质病毒的存在.另外,制备了包含脊髓灰质病毒特异性核酸片段的阳性质粒标准品,为开展水体环境中有害病毒的检测工作奠定研究基础.

滋补肝肾方激活小鼠B-16黑色素瘤细胞线粒体ATP合成酶-6的基因表达

目的研究滋补肝肾方复方及单方对小鼠 B-16黑色素瘤细胞酪氨酸酶 mRNA 表达的影响及滋补肝肾方的分子作用机制。方法定量逆转录 PCR 法(quantitative reverse transcriptional polymerase chain reac-tion,QRT-PCR)研究滋补肝肾方复方及单方对小鼠黑色素瘤酪氨酸酶 mRNA 表达的作用;mRNA 差别显示(mRNA differential display reverse transcriptional polymerase chain reaction,DDRT-PCR)法研究用滋补肝肾方复方及单方处理 B-16黑色素瘤细胞前后基因的差别表达。结果滋补肝肾方复方及各个单方并非都能够增加酪氨酸酶 mRNA 的表达量;但是滋补肝肾方复方和某些单方却能够激活小鼠黑色素瘤 B-16细胞线粒体 ATP合成酶-6(ATPase-6)基因的特异性表达。结论 QRT-PCR 结果表明不能将滋补肝肾方的治疗作用单纯解释为是酪氨酸酶表达提高的结果,而可能存在其他的作用机制,DDRT-PCR 结果表明 ATPase-6基因表达的激活可能是滋补肝肾方作用的关键环节。

日本白鲫生长激素-I基因编码区cDNA的克隆(英文)

从日本白鲫(carassiuscuvieri)脑下垂体中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增出日本白鲫生长激素 IcDNA编码区,克隆到Pucm T载体上.序列测定表明日本白鲫生长激素 I基因的开放阅读框含有630bp,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,日本白鲫生长激素 I基因的克隆成功为该基因的功能及应用研究奠定了基础。

肝癌细胞中γ-谷氨酰转肽酶基因甲基化研究

目的:研究肝癌细胞中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)甲基化的改变。方法:纯化人肝癌及癌旁组织中总GGT及RNA,观察总GGT、膜结合和可溶性GGT的表达,并以逆转录巢式PCR扩增GGT非编码区基因片段,分析M_3位点的甲基化状态。结果:肝癌、癌旁和远癌组总RNA浓度呈明显的梯度升而趋势(P<0.05);癌组织总GGT、膜结合和可溶性GGT均高于癌周又远癌组织(P<0.05);在癌、癌旁及远癌组织中,特定基因片段的扩增检出率分别为100％、85％、75％,M_3位点低甲基化频率分别为75％、55％、50％。结论:肝癌组织中GGT呈异常表达与基因低甲基化状态有关。

AML1-ETO转基因小鼠的建立及初步表型分析

目的:建立AM L1-ETO融合基因转基因小鼠,在整体动物水平研究AM L1-ETO融合蛋白在白血病发病中所起的作用。方法:构建hCG/AM L1-ETO转基因质粒,通过显微注射将该质粒转入小鼠受精卵中,植入假孕母鼠输卵管,获得G0代转基因小鼠;用聚合酶链反应(PCR)方法检测融合基因的整合情况,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测融合基因的表达情况和组织表达谱。结果:PCR法共检出10只G0代转基因阳性小鼠,其中8个系均产下F1代小鼠,由此建立了8个AM L1-ETO转基因小鼠系。RT-PCR法证实AM L1-ETO融合基因在22系中稳定表达,但血常规、肝脏、脾脏等组织未见异常变化;对该系小鼠的组织表达谱检测表明,融合基因在肝脏、脾脏、心脏和肌肉组织存在不同程度的表达,但在脑组织中不表达。结论:AM L1-ETO融合基因能在转基因小鼠的骨髓等组织中表达,但尚不足以引发白血病,推测其他致病基因在小鼠白血病的发生中也起一定作用。

不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用分析

目的比较不同分子生物学方法检测手足口病标本的敏感性及应用价值。方法选取山东莘县疾病预防控制中心2012年1月～2013年8月收集的100例手足口病标本为研究对象，根据分子生物学检测方法不同，将其分为巢式PGR组、一步法RT-POR,（逆转录－聚合酶链反应）组及实时RT-POR,组，对3组肠道病毒71型检测阳性率结果进行对比分析。结果巢式PCR对住院标本、轻症标本及重死标本检测的EV71阳性率分别为8462％、25％及83．33％，实时RT-PCR检测的80．77％、23.31％及77.78％，均明显高于一步法RT－PCR检测的15.38％、8.92％、44.44％，比较有统计学意义（P〈0．05）。结论手足口病原体主要是EV71及CA16，且巢式PCR和实时RT－PCR生物检测敏感性相对一步法RT－PCR要高。

癌胚抗原mRNA、人中性粒细胞多肽1-3联合检测在结直肠癌诊断中的价值

目的:探讨外周血癌胚抗原信使核糖核酸(CEAmRNA)、中性粒细胞多肽1-3(HNP1-3)单一检测及联合检测在结直肠癌诊断中价值。方法:选取结直肠癌70例患者为观察组,另选良性疾病患者70例为对照组。分别采用Nested RT-PCR法检测CEAmRNA,ELISA法检测HNP1-3,观察两组患者CEAmRNA及HNP1-3的表达。结果:CEAmRNA对结直肠癌的诊断敏感度为52.86%,特异度为98.57%;HNP1-3对结直肠癌的诊断敏感度为60%,特异度为98.57%。两者联合检测时至少1项阳性敏感度为77.14%,特异度为97.14%,2项均阳性敏感度为42.85%,特异度为100%。CEAmRNA、HNP1-3的表达与淋巴结转移及Dukes分期相关。结论:在结直肠癌诊断中,外周血CEAmRNA和HNP1-3二者平行相关检测具有更高价值和诊断意义。

大肠癌金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的研究

目的 了解大肠癌患者金属蛋白酶组织抑制因子 1基因表达的情况。方法 5 0例大肠癌术中取癌组织及正常大肠组织 ;提取组织总RNA ;用逆转录共扩增定量PCR方法测定其金属蛋白酶组织抑制因子子 1(TIMP 1)基因表达水平。结果 大肠癌组织金属蛋白酶组织抑制因子 1基因表达水平明显高于正常大肠组织。局部淋巴结受累者TIMP 1基因表达水平明显低于局部淋巴结未受累者。结论 金属蛋白酶组织抑制因子 1在阻止大肠癌的浸润、转移中可能起重要作用。

PCR-荧光探针法在中国HCV常见基因型检测中的意义

目的 探讨聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）-荧光探针法在检测丙型肝炎病毒（HCV）基因型中的应用价值.方法 随机选择2016年3月至6月来自全国各地的166例慢性HCV感染者血清样本,采用逆转录巢式PCR扩增HCV的Core-E1（CE1）基因区域和测序、系统发育树分析确定基因亚型,并采用PCR-荧光探针法对HCV基因型进行检测.采用Kappa检验对两种方法测得的HCV分型结果进行比较.结果 巢式PCR测序法共分型166例,其中1 b型66例（39.8%）,2a型34例（20.5%）,3a型16例（9.6%）,3b型为27例（16.2%）,6a型23例（13.9%）;PCR-荧光探针法共分型166例,其中1 b型68例（41.0%）,2a型34例（20.5%）,3a型16例（9.6%）,3b型25例（15.0%）,6a型23例（13.9%）.PCR-荧光探针法分型中的2例1 b型,测序法分型为3b型,两种方法检测一致率为98.7%（164/166）,差异无统计学意义（χ2=0.0492,P〉0.05）.

TNF-α和TGF-β1在胚胎停育患者蜕膜组织中的表达

目的 探讨蜕膜组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达与胚胎停育的关系。方法 选取2020年11月至2021年10月就诊于该院妇产科门诊经B超确诊为胚胎停育的患者40例为观察组,另选取同期正常妊娠并要求人工流产的孕妇40例为对照组。采用免疫组织化学法与实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测两组蜕膜组织TNF-α和TGF-β1及其mRNA表达水平并比较。以两组蜕膜组织中TNF-α和TGF-β1 mRNA相对表达水平的均值为临界值将患者分为不同亚组,进一步分析TNF-α和TGF-β1 mRNA表达水平与胚胎停育的关系。结果 免疫组织化学结果显示,观察组蜕膜组织中TNF-α、TGF-β1阳性表达率分别为80.0%、 52.5%,对照组分别为47.5%、75.0%;观察组蜕膜组织中TNF-α表达程度高于对照组,TGF-β1表达程度低于对照组,差异均有统计学意义(Z=-3.622、3.898,P<0.05)。RT-qPCR结果显示,观察组蜕膜组织中TNF-α mRNA相对表达水平高于对照组(6.16±1.25 vs. 1.02±0.02),TGF-β1 mRNA相对表达水平低于对照组(0.59±0.19 vs. 1.03±0.03),差异均有统计学意义(t=26.144、-14.199,P<0.05);分别以蜕膜组织TNF-α和TGF-β1 mRNA相对表达水平3.59、0.81为临界值进行分析,TNF-α和TGF-β1 mRNA相对表达水平与胚胎停育的发生有关(OR=0.050,95%CI:0.013~0.193,P<0.001;OR=0.125,95%CI:0.055~0.284,P<0.001)。结论 蜕膜组织TNF-α表达升高,TGF-β1表达降低可能与胚胎停育有关。

与人类关系密切的7种动物对戊型肝炎病毒易感性的初步研究

目的 用双抗原夹心法ELISA (DS -ELISA)和逆转录巢式PCR法 (RT -nPCR)研究与人类生活关系密切的猪、犬、山羊、鸡、鸭、鸽子和兔等 7种动物对戊型肝炎病毒 (HEV)的易感性。方法 用多基因型HEV重组蛋白建立检测HEV抗体的DS -ELISA ,并用于 5 91份猪、警犬、家犬、宠物犬、山羊、鸡、鸭、鸽子和兔等多种动物血清标本的HEV抗体检测 ;用HEV多基因型通用性引物RT -nPCR扩增 14 3份犬血清标本HEVRNA。结果 在猪、家犬和宠物犬血清标本中检测到HEV抗体 ,阳性率分别为 4 3 93%、15 19%和 4 6 5 % ,但在警犬、山羊、鸡、鸭、鸽子和兔血清标本中未检测到HEV抗体 ;14 3份犬血清标本用RT -nPCR未扩增出HEVRNA。结论 用多基因型HEV重组蛋白建立的双抗原夹心法ELISA适用于多种动物血清标本HEV抗体的检测 ;猪和犬对HEV易感 ,在HEV传播中可能起重要作用。

儿童急性淋巴细胞白血病常见融合基因的检测及意义

目的建立逆转录-巢式PCR检测融合基因的方法,检测4种常见融合基因在儿童急性淋巴细胞白血病中阳性率,并对阳性患儿进行初步临床资料分析。方法对收治的92例初发的急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿,于化疗开始前抽取骨髓标本1.5～2.0 ml,采用巢式RT-PCR方法检测最常见的4种融合基因:TEL/AML1、E2A/PBX1、m-BCR/ABL和AF4/MLL。结果92例ALL患儿中TEL/AML1阳性21例,阳性率22.8%,占B细胞性ALL的24.7%(20/81例);6例E2A/PBX1阳性(6.5%),在前B细胞性ALL中占20.0%(3/15例);2例AF4/MLL阳性(2.2%),在婴儿ALL中占33.3%(2/6例);仅检测到1例m-BCR/ABL阳性(1.1%)。结论巢式RT-PCR方法是检测融合基因有效、敏感的方法。TEL/AML1在儿童ALL中阳性率最高,尤其是在B细胞性ALL中,该融合基因阳性的患儿病情较轻。

上海地区猪群中戊型肝炎病毒的流行情况

猪戊型肝炎是一种人畜共患病，为了异清上海地区猪群中戊型肝炎的流行情况，评估其感染人的风险，于不同季节调查上海地区不同区（县）规模化猪场中不同月龄猪戊型肝炎病毒的感染状况。试验应用逆转录-巢式聚合酶链法（RT-nPCR）对9个区（县）51个猪场（次）的猪粪便标本和1个生猪屠宰中心的127份猪胆汁标本进行HEV RNA检测，结果为51个猪场次中31场次为阳性，阳性率为60．78％。1699份猪粪便标本中201份为HEV RNA阳性，阳性率为11．83％；阳性标本季节分布明显，以夏秋季为主，平均阳性率为14．63％，而冬春季平均阳性率为5．91％；1月龄以内的仔猪感染率低于10％，为8．60％，其他均在10％～15％左右；9个养猪的区（县）中均存在戊型肝炎病毒的感染，但差异也较大，最高为18．30％，而低的只有0．61％。127份猪胆汁标本中有9份为阳性，阳性率为7．09％。结果说明上海地区的猪群中存在着较为广泛的猪戊型肝炎病毒的感染，提示密切接触者存在感染的风险。

肝素酶表达鉴别良、恶性腹水无价值

目的:研究腹水脱落细胞及腹膜活检标本中肝素酶的表达,探讨肝素酶用于鉴别良、恶性腹水的可行性.方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测47例腹水脱落细胞中肝素酶mRNA的表达,同时利用免疫组织化学法检测肝素酶蛋白在36例腹膜活检标本中的表达,与相关的临床资料进行分析.结果:肝素酶mRNA在良、恶性腹水脱落细胞中的表达无明显差异(P>0.05).在腹膜活检标本中,肝素酶蛋白不仅存在于腹膜癌细胞中,在结核性腹膜炎上皮样细胞、郎格罕巨细胞、淋巴细胞中及异位的子宫内膜细胞及其间质细胞中均有表达;免疫组织化学法检测腹膜组织中,良、恶性腹水组之间的肝素酶阳性率亦无显著性差异(P>0.05).结论:肝素酶在良性腹水中的高表达可能与腹水脱落细胞中的炎性细胞增高有关.腹水脱落细胞中肝素酶mRNA的表达不能用于良恶性腹水的鉴别.

多发性骨髓瘤血小板生成素及受体初步研究

目的探讨多发性骨髓瘤患者血浆血小板生成素(Thrombopoietin)及受体基因(C-mpl-mRNA)的变化及其意义。方法选择34例多发性骨髓瘤患者按Durie-Salmon分期分成第Ⅰ期(A组),第Ⅱ期(B组),第Ⅲ期(C组),正常对照组健康成人30例。用夹心酶联免疫吸附法(ELISA)和半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测对照组及各实验组化疗前后血浆TPO及C-mpl基因表达水平。结果各实验组TPO及C-mpl-mRNA表达均明显高于正常对照组(P<0.05);C组表达明显高于A组与B组(P<0.05);A组与B组间无显著差异。实验组TPO及C-mpl-mRNA表达水平与骨髓瘤分期成正相关(r=0.423,0.436,P<0.05);化疗后TPO及C-mpl-mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。结论血浆TPO及C-mpl基因表达水平可在一定程度上反映多发性骨髓瘤病变程度,化疗能降低TPO及C-mpl-mRNA基因表达水平。