双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断中的建立

目的 运用逆转录 -半套式 -聚合酶链反应技术 (RT -semi-nested -PCR) ,建立一种新的早期快速检测乙型脑炎病毒的方法。方法 收集临床诊断的 37例乙脑和 15例非乙脑病人标本 (包括血清、脑脊液 )分别为 6 3份和 30份 ,同时用RT -semi-nested -PCR、IgM捕获法ELISA(MacELISA)进行检测。 结果 血清和脑脊液中可成功检测出JEVRNA ,经1 5 %凝胶电泳 ,出现特异性条带 ,符合预计值 4 0 0bp。结论 RT -semi-nested -PCR对检测JEV感染 ,从实验设计到实验条件 ,都是合理的 ,有较高的敏感性和特异性。可用于乙脑的早期诊断。

用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的 探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法 建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果 优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论 为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。

用逆转录-聚合酶链反应检测乳腺癌患者骨髓微转移30例报道

目的 :通过分子生物学技术检测乳腺癌患者的微转移灶。方法 :患者常规行乳癌根治术 ,在完成皮瓣游离后 ,于胸骨柄处行骨穿 ,吸取骨髓 3～ 4ml,所采骨髓行RT -PCR检测其细胞角蛋白 19(KT19)含量。切除标本常规送病理。结果 :30例患者临床病理汇报同侧腋窝淋巴结转移阳性 17例 ,胸骨骨髓KT19阳性 7性 ,占4 1.12 % ,其中 3例肿块直径≥ 5 .0cm ,位于内乳内 ,临床未触及锁骨上淋巴结肿大 ;同侧腋窝淋巴结转移阴性13例 ,胸骨骨髓KT19阳性 3例 ,占 2 3.0 7%。总阳性率 33.33%。结论 :在术中游离皮瓣后于胸骨柄处进行骨穿获取骨髓 ,并转应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)检测细胞角蛋白 19(KT19)在胸骨骨髓中的表达 ,可以早期诊断乳腺癌的微转移。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

逆转录聚合酶链反应方法检测新生儿病房柯萨奇B_3病毒感染

目的:探讨逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法在检测柯萨奇病毒B3(CoxB3)感染中的作用。方法:采用RT-PCR方法对北京某医院31对(62例)疑似有母婴传播性CoxB3感染的新生儿和母亲血样进行CoxB3病毒的RNA检测。结果:62例样本经血清学检测,只有1例新生儿CoxB3病毒抗体阳性,阳性率为1.61%。经RT-PCR方法检测,62例血样中有12例检测结果为阳性,阳性率为19.35%;其中4对母、婴均阳性,2对新生儿阳性、母亲阴性,还有2对母亲阳性、新生儿阴性。其余23对母婴均为阴性。结论:RT-PCR法对于早期CoxB3感染检测的阳性率优于血清学检测方法,对确定病毒的传播途径有参考价值,同时可以早期预防病毒感染在新生儿中的爆发。RT-PCR法具有快速、敏感、特异性强等特点,是快速、有效检测CoxB3病毒感染的诊断方法之一。

逆转录-聚合酶链反应诊断IBDV的免疫后感染

用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对 5个养鸡场的 13份病死鸡腔上囊、腺胃标本进行了检测 ,诊断为免疫后感染传染性腔上囊病毒 (IBDV) 。

逆转录聚合酶链反应检测鼻息肉环氧合酶-2mRNA表达

目的检测研究环氧合酶-2(cyclooxygenase-,COX-2)mRNA在鼻息肉组织中的表达水平,深入认识鼻息肉炎性发病机制。方法利用逆转录-聚合链反应(RT-PCR反应)检测35例鼻息肉组织及23例下鼻甲标本的环氧合酶-2的表达。结果鼻息肉组织中COX-2mRNA表达明显高于下鼻甲正常黏膜。结论鼻息肉组织中COX-2表达明显增高,鼻息肉发病过程中有前列腺素参与。

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

尿苷酶在丙型肝炎病毒逆转录-抗污染-联体聚合酶链反应中的应用

目的:建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)逆转录-抗污染-联体聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),并优化尿苷酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG)的抗污染剂量和抗污染时间。方法:逆转录-抗污染-联体PCR技术的第1次PCR实行逆转录-抗污染-PCR同步化;第2次PCR经分层蜡处理进行全程抗污染,并应用该技术扩增HCV cDNA,制备全含脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)的DNA(dU-DNA)为模板,作为UDG实验室抗污染质控对照并验证该联体PCR检测HCV RNA灵敏度,用DNA-酶免疫测定技术检测HCV cDNA。结果:抗污染实验结果证实,0.2u的UDG在37℃和42℃40min均可达到抗污染的效果。对高浓度全dU-DNA模板也有良好的抗污染效果。灵敏度检验结果表明,用HCV RNA浓度为2.110×105copies/mL的血清,稀释到10-4倍后仍可检测出HCV RNA。结论:应用该逆转录-抗污染-联体PCR技术进行全程抗污染,减少了因程序中多次加样造成的污染,为HCV逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测RNA提供良好的防污染和抗污染操作技术。

人乳腺癌特异性基因1 mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测试剂盒的建立及应用

目的建立人乳腺癌特异性基因1(BCSG1)mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测试剂盒,并评价其在乳腺癌循环肿瘤细胞检测中的应用价值。方法优化试剂盒中各组分的浓度、确定试剂盒的稳定性、灵敏度及特异性,并检测外周血样品中BCSG1 mRNA的表达水平。结果优化了试剂盒中的引物、探针,成功制备了定值标准品,通过设立阴、阳性质控品的方法,解决了试剂盒的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等关键技术问题,特异度及准确性均为95%以上,灵敏度为100拷贝/ml(全血)。外周血标本中BCSG1 mRNA的检测结果为,12例临床确诊已转移的乳腺癌患者均为阳性,21例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12例为阳性,其余9例为阴性,15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性。结论建立的BCSG1 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有很高的临床应用价值,可用于检测外周血样品中BCSG1mRNA的表达量,检测结果可作为乳腺癌患者诊疗过程中的重要监测指标。

竞争性逆转录-聚合酶链反应对哮喘患者诱导痰白细胞介素-10基因表达的定量分析

目的:建立竞争性逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)定量方法,监测哮喘患者白细胞介素-10(IL-10)基因的表达水平,探讨IL-10在哮喘气道炎症中的作用和临床意义。方法:用酶切法构建IL-10内标分子,用已知量的该内标分子,通过竞争性RT-PCR对哮喘组(30例)和对照组(29例)的诱导痰和外周血IL-10 mRNA进行定量分析。结果:哮喘发作期患者的诱导痰和外周血绝大多数未检测到IL-10 mRNA,部分缓解期患者有少量IL-10 mRNA表达。健康对照者外周血和诱导痰均有IL-10 mRNA表达。结论:哮喘患者的气道炎症过程与IL-10基因表达有关,且存在IL-10转录水平的合成障碍。

逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法检测呼吸道合胞病毒及其亚型感染

目的:建立一种呼吸道合胞病毒(RSV)及其亚型核酸检测方法并初步应用于临床,检测浙南地区RSV及其亚型的流行情况。方法:根据RSVG蛋白基因核苷酸序列设计引物和探针,通过逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法(RT-PCR-ELSH)随机检测了浙南地区连续两年冬春季期间202例急性下呼吸道感染的婴幼儿鼻咽部分泌物中RSV及其亚型的病毒核酸;与病毒分离培养、直接免疫荧光法(DFA)、OligoDetect试剂盒比较探讨其临床实用性。结果:202例标本中RSV阳性123例,阳性检出率为60.9%,2002～2003年和2003～2004年冬春季分别为68.2%和52.6%;两个冬春季都以RSVA亚型为主,占78.9%,2002～2003年冬春季A亚型占RSV阳性标本中的76.7%,2003～2004年A亚型占82.0%;RT-PCR-ELSH阳性检出率与其他三种方法的阳性检出率差异无显著性(P>0.05)。结论:RT-PCR-ELSH法用于检测RSV及其亚型,是一种灵敏度高、特异性强,方便、快速的方法,非常适用于临床标本的大批量检测和流行病学调查;RSV是引起浙南地区冬春季婴幼儿急性下呼吸道感染的最主要的病原体,并以A亚型为主。

人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的竞争性逆转录-聚合酶链反应定量分析

为建立人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达检测方法 ,研究载脂蛋白E基因与儿童健康的关系 ,我们抽取 2 6例健康儿童外周静脉血 ,分离血单核细胞 ,抽提RNA ,采用逆转录—聚合酶链式反应检测载脂蛋白E基因表达 ,并以正常人cDNA作定量标准物 ,待测样品与定量标准物共扩增 ,计算出待测样本的个体的mRNA量。研究发现载脂蛋白E基因能在健康儿童周围血单核细胞表达 ,健康儿童载脂蛋白E基因表达量为 0 .37± 0 .15mol/molmRNA。表明采用竞争性逆转录—聚合酶链反应方法来检测人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的分析方法快速、简便、灵敏、实用、可靠 ,且能准确定量 ,值得推广应用。

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎减毒活疫苗生物反应罐清洁验证中的应用

为了对乙型脑炎减毒活疫苗生物反应罐清洁后乙型脑炎病毒(JEV)检测方法进行探讨,从GenBank中收录的乙型脑炎病毒的E蛋白基因序列设计一对引物,以乙型脑炎减毒株SA14-14-2培养物提取RNA作为模板,进行逆转录和PCR扩增。结果表明乙型脑炎减毒株SA14-14-2扩增出预期的特异性条带,阴性对照没有扩增出任何条带。聚合酶链反应与血吸附试验比较,有灵敏、快速、稳定性的特点,可用于生物反应罐清洁后乙型脑炎残留病毒的检测。