双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”李矮缩病毒

为选择不携带主要病毒的植株,利用作者已建立的PDVRT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带PDV的情况进行了调查,结果表明,被检植株PDV的感染率达90%,但程度不同。

逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”主要病毒

目的:调查“歇马杏”携带主要病毒的情况。方法:利用作者已建立的ACLSV、PNRSV和PDV RT-PCR检测体系对辽宁省大连市地方特产“歇马杏”田间植株携带三种病毒的情况进行了调查。结果:被检植株ACLSV、PNRSV和PDV的单独感染率分别为83.33%、83.33%和90%,复合感染率达到76.67%,但带毒程度不同。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

硅-玻璃聚合酶链式反应微芯片对β-葡糖苷酸酶基因的扩增

聚合酶链式反应 (PCR)微芯片是基于微机电系统 (MEMS)制作 ,在微芯片上进行PCR反应 ,实现生物样品扩增的一项新技术 .介绍了硅 玻璃PCR微芯片的设计和制作、微反应腔的清洗和表面处理、借助外置温度控制系统进行PCR扩增反应以及扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下的检测分析 ,实现了对 β 葡糖苷酸酶 (GUS)基因的有效扩增 ,扩增时间由原来的 90min缩短到现在的 37min .

逆转录-PCR扩增文昌鱼LIM类同源框基因片段

于1997年6月在青岛市沙子口海域采集文昌鱼样品，采用RT-PCR方法进行青岛文昌鱼LIM类同源框基因片段的扩增研究。结果表明，用一对引物一次PCR扩增的方法未能得到特异的PCR产物，用一对引物两次PCR扩增的方法也同样未果。在对套式PCR进行研究时发现，用普遍PCR方法进行的套式PCR结果不够理想，而用三步两段法和四步两段法套式PCR则可进行成功的扩增。用这两种方法扩增的PCR产物具有高度特异性。相比之下，用简并的引物对未知的基因片段进行PCR扩增时，三步两段法和四步两段法的套式PCR应是首选方法。

半定量RT-PCR检测钙调磷酸酶抑制剂对IL-2，IL-4，IFN-γmRNA表达的影响

目的利用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,测定细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)mRNA表达水平,研究其在肾移植患者术后,钙调磷酸酶抑制剂治疗的疗效评价中的应用。方法取肾移植后患者外周血分离淋巴细胞,提取总RNA,进行RT-PCR反应,通过光密度扫描进行半定量分析;结合治疗药物监测结果分析。结果他克莫司(FK506)组3种细胞因子表达显著低于环孢素(CsA)组,且离散程度小。血药浓度谷值(ρ0)与细胞因子表达相关性不强。CsA组3种细胞因子之间的相关性比FK506组好。尿蛋白阳性的患者较阴性患者血清肌酐(Cr)显著升高,且IL-4表达显著升高。结论钙调磷酸酶抑制剂的个体敏感性差异很大。IL-2,IL-4,IFN-γmRNA的表达可以作为血药浓度的重要补充,为个体化给药提供依据。

晶状体上皮细胞mRNA定量分析中内部参照标准β-肌动蛋白RT-PCR反应条件的研究

目的 探讨晶状体上皮细胞mRNA定量分析中内部参照标准β-肌动蛋白RT-PC反应条件。方法 从培养的人晶状体上皮细胞中提取mRNA，应用设计的引物RT-PCR检测β-肌动蛋白，电泳分析53.2℃、53.9℃、55℃、56.2℃、57.4℃、58.6℃、59.8℃、60℃、62℃、62.7℃不同的退火温度的扩增产物。结果 各退火温度条件下，β-actin扩增产物均形成长度为302bp片段，且未见非特异性扩增产物条带。退火温度为58.6℃时，β-actin扩增产物的条带最清晰。结论 采用本实验中所设计的引物联合58.6℃退火温度等实验条件所扩增的长度为302bp片段，清晰稳定，是晶状体上皮细胞mRNA定量分析中良好的内部参照标准。

β冠状病毒通用RT-PCR检测方法建立及昆明地区动物带毒状况调查

为调查昆明地区猪、牛及鼠β冠状病毒携带状况及充当重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2中间宿主的可能性,建立基于β冠状病毒属RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的特异性逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法,并用于2020—2021年昆明9个县区具有呼吸道或消化道症状的猪(186份)、牛(164份)及随机捕获的鼠(140份)的β冠状病毒核酸检测;对RdRp阳性样品进一步进行SARS-CoV-1和SARS-CoV-2刺突蛋白(S)基因特异性扩增。建立的RT-PCR方法能特异扩增β冠状病毒属各病毒种,对SARS-CoV-2核酸检测的灵敏度为310个质粒拷贝;应用该法检测的490份样品中,猪、牛、鼠的β冠状病毒检出率分别为5.91%、9.76%和8.57%,但RdRp阳性样品未检出SARS-CoVs的S基因同源片段。成功建立可特异检测β冠状病毒属的通用RT-PCR方法,应用该法联合S基因扩增调查昆明地区猪、牛及鼠,未发现其携带与SARS-CoVs的S基因有联系的β冠状病毒。

RT-PCR法对感染性疾病患者检测效能分析

目的探讨2种分子生物学检测方法对病原微生物感染疾病患者的检测效果,并观察愈后患者焦虑抑郁状态改善。方法将实验室病理组织学检测确认病原微生物感染的48例患者作为病例组以及无病原微生物感染的42例患者作为对照组,分析比较聚合酶链反应、逆转录酶-聚合酶链锁反应检测结果,并依据医院焦虑抑郁量表评估患者愈后心理状态改善情况。结果逆转录酶-聚合酶链锁反应的病原微生物检测总阳性率(95.83%,46/48)高于聚合酶链反应检测结果(83.33%,40/48),差异有统计学意义(P<0.01)。逆转录酶-聚合酶链锁反应检测灵敏度、特异度均高于聚合酶链反应检测,差异均有统计学意义(P<0.01)。治疗愈后患者的医院焦虑抑郁量表的焦虑、抑郁维度评分均低于治疗前,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论逆转录酶-聚合酶链锁反应检测技术在病原微生物感染患者中的检测效果高于聚合酶链反应检测技术。病原微生物感染愈后患者的焦虑抑郁症状的改善明显。

RT-PCR技术在新型冠状病毒核酸检测的应用及质量评价分析

在新型冠状病毒感染患者的诊断中,采取有效检测方式进行及早诊断尤为重要。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术有较高灵敏度和特异度。本文分析临床应用RT-PCR技术检测新型冠状病毒的常见问题和应对策略,旨在为疫情防控常态化形势下临床实验室正确、高效开展新型冠状病毒检测提供参考意见。

应用RT-PCR方法检测桃和樱桃及其组培苗上的PNRSV和PDV

报道了PNRSV和PDV的RT-PCR检测的优化体系。利用该体系在北京和大连地区对露地桃树和樱桃树以及甜樱桃茎尖组培苗携带PNRSV和PDV的情况进行了调查,结果表明被检材料这2种病毒的感染率均较高,但程度不同。

水稻GA20ox-2基因mRNA的TaqMan荧光定量RT-PCR检测

成功建立了一项基于TaqMan实时荧光定量的RT-PCR技术,定量分析水稻半矮化关键基因之一GA20ox-2转录水平。该技术体系中重组质粒标准品的制备方法具有很好的实用性;质粒标准品对基因GA20ox-2表达的实时定量准确、可靠、便捷。标准曲线表明,所建立的GA20ox-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,灵敏度高,可达102拷贝;线性范围广,可达102～107拷贝;扩增效率高(E=100.3%);稳定性、重复性好,可靠性高,批内和批间变异系数仅分别为0.12%～0.31%和0.21%～0.34%;循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=0.999),可对GA20ox-2基因表达进行准确实时定量。

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。

苹果茎沟病毒RT-PCR检测技术

用苹果的叶片作为材料,研究比较了两种提取苹果总RNA方法的效果,确定了较好的提取方法。根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因设计引物,通过RT-PCR扩增在苹果叶片总RNA样品中获得了524 bp的特异片断,通过对该片段的序列分析与苹果茎沟病毒外壳蛋白基因源序列比较,其同源性高达93%。通过多次重复实验验证,该方法能很好地检测苹果茎沟病毒。

竞争RT-PCR方法检测Ctr1基因mRNA变化的内参构建

构建定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)的内参标准 ,用以检测铜代谢过程中Ctr1基因mRNA表达的变化情况。采用双引物 ,经 2次克隆将 4 0 0bp左右的外源基因片段插入到 5 30bp目的片段的单酶切位点中 ,构建成突变型DNA阳性竞争重组质粒。结果 ,成功构建了 930bp左右的竞争模板重组质粒。

RT-PCR检测乳腺癌患者外周血表皮生长因子受体和细胞角质蛋白-19mRNA的表达

目的 探讨逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR )方法检测乳腺癌患者外周血表皮生长因子受体(EGFR)mRNA作为乳腺癌循环肿瘤细胞标志的可能性及意义。方法 以转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,分别对40例乳腺癌患者和30例健康人静脉血进行EGFRmRNA检测,同时与目前研究较多的循环上皮细胞标志:细胞角质蛋白CK-19的mRNA做比较。结果 在30例健康人外周静脉血中没有发现EGFRmR NA的表达( 0% ),但有8例CK-19阳性( 26. 7% )。而40例乳腺癌患者检测出13例EGFRmRNA阳性(32. 5% ),与正常人相比P<0. 01,两组间存在显著性差异;CK-19的mRNA阳性例数为14 (35. 0% ),与正常人相比P>0. 05,两组间无统计学差异。通过免疫组化检测到25例( 62. 5% )的肿瘤组织中EGFR阳性,所有外周血中EGFRmRNA阳性的病例,相应的原发肿瘤病灶中EGFR蛋白均为阳性,组织中EGFR蛋白高表达的患者外周血EGFRmRNA检出率也高(P<0. 01)。26例初治患者中5例EGFRmRNA阳性(19. 2% ),14例复治患者中8例EGFRmRNA阳性(57. 1% ),两组相比P<0. 05,存在显著性差异。6例曾使用过紫杉醇类药物挽救化疗的转移性患者中1例EGFRmRNA阳性(16. 7% ), 8例未使用过紫杉醇类药物挽救化疗的转移性患者中7例EGFRmRNA阳性(87. 5% ),两组相比P<0. 05,存在显著性差异。