逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨

目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录 巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区域最小自由能与RT nPCR扩增效率的关系。结果 :4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段 ,但得到的PCR滴度有差异 ,D组引物所得滴度最高 ,B组最低 ;5 4份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低 ,B组的最高 ,与PCR扩增效率相关。结论 :在HEV基因组第 62 96～ 660 3核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本 ,扩增效率高 。

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革 1～ 4型病毒的多重逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革 1～ 4型病毒核酸序列设计多重RT PCR引物 ,并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性 ,随后对PCR反应条件进行优化 ,以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照 ,验证其特异性。并对 2 0 0 3年 30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测 ,阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革 1～ 4型病毒进行扩增 ,分别获得 2 95、2 37、118、347bp片段 ,与设计相符 ;而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带 ,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ,30份疑似患者血标本RT PCR扩增阳性率为 83.3% (2 5 / 30 ) ,其核酸序列与登革 1型病毒柬埔寨株以及中国 1997、1999年流行株GD14 / 97、GD0 5 / 99同源性分别为 97%、97%、98%。结论 实验证明 ,所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革 1～ 4型病毒 ,为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。

套式逆转录聚合酶链反应在黄热病毒快速检测中的应用

目的建立灵敏、特异的套式逆转录聚合酶联反应(RTPCR)快速检测黄热病毒方法。方法参照黄热病毒标准株D17序列设计套式引物,并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性,随后对镁离子、dNTP及引物浓度,PCR反应条件进行优化,建立稳定、特异的套式RTPCR快速检测黄热病毒方法,并以同属于黄病毒科的登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎病毒为对照,验证其特异性。结果外引物扩增可获得404bp左右的特异性扩增片断,阴性对照毒株未见设计大小的扩增片断,但可见非特异性片断;内引物扩增可获得349bp左右片断,阴性对照无扩增条带。结论套式RTPCR可快速、灵敏、特异的检测黄热病毒。

用逆转录聚合酶链反应方法检测SARS冠状病毒

目的 应用双位点逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)和改良巢式实时RT PCR方法检测临床标本中SARS冠状病毒(SARS CoV)核酸,以提高检测的可靠性和灵敏度。方法 对 2003年杭州市 3例严重急性呼吸综合征(SARS)临床确诊患者、4例疑似和 27名医学观察者的咽拭子标本用巢式实时RT-PCR检测SARS- CoV核酸,对阳性扩增产物进行核酸序列测定,同时对 3例患者的标本应用半巢式RT -PCR检测另一位点SARS- CoV核酸片段,并应用常规实时RT- PCR技术及改良实时RT -PCR技术进行检测。结果 3例患者的巢式RT -PCR检测结果 2例阳性, 4例疑似和 27名医学观察者均为阴性;阳性扩增产物的核酸序列与SARS- CoV基因组相应部分序列完全一致。3例患者标本的另一位点的半巢式RT -PCR及实时RT PCR结果均相同。在检测低拷贝数标本时,常规实时RT- PCR技术在约 35个循环后出现弱阳性信号,但改良的巢式实时RT -PCR技术可使强阳性信号在 10个扩增循环后出现。结论 双位点RT- PCR方法是提高检测准确性的有效方法,改良巢式实时RT- PCR技术较常规实时RT- PCR技术具有更高的灵敏度。

RT-LAMP与RT-PCR法快速检测脑脊液结核分枝杆菌的效果比较

目的探讨逆转录(RT)-环介导等温扩增(RT-LAMP)法、RT-聚合酶链反应(PCR)法检测脑脊液结核分枝杆菌(MTB)的效果,为其快速诊断及临床药效评估提供依据。方法选取2015年12月至2017年4月解放军白求恩国际和平医院就诊的85例患者脑脊液标本进行研究,并将其分为TBM组(46例)、疑似TBM组(25例)和对照组(16例),根据结核分枝杆菌16SrRNA区段,设计特异性引物,建立RT-LAMP和RT-PCR检测技术体系,对两种方法的检测结果进行分析。结果 TBM组阳性检出率分别为97.8%和75.0%,疑似TBM组阳性检出率分别为76.0%和40.0%,对照组阳性检出率分别是0.0%和12.0%,各组RT-LAMP法阳性检出率高于RT-PCR法,差异有统计学意义(P<0.01);对照组中,采用RT-PCR法检测时发现非特异性扩增,采用RT-LAMP法检测时未见非特异性扩增,RT-LAMP法检测特异性强于RT-PCR法;RT-PCR法检测灵敏度为100CFU/mL,高于RT-LAMP法的1CFU/mL。结论 RT-LAMP法检测MTB时具有简便、灵敏快速、可检测活菌特点,与PCR法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望成为基层、野战医疗单位及发展中国家等的常规检查工具。

甲_3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用

目的建立适用甲3型流行性感冒(流感)病毒核酸检测的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法,为基层实验室流感快速诊断服务。方法对甲3型流感病毒设计两对环介导特异性引物与一个环引物,采用环介导RT-LAMP技术对甲3型流感病毒核酸进行等温扩增,并对反应体系进行优化。结果采用RT-LAMP技术检测甲3型流感病毒核酸,敏感度可达0.01TCID50/反应,与荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的敏感度相一致,且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应,具有良好的特异性。采用该方法检测58份临床样本,病毒分离的阳性率为37.9%,而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%,敏感度明显高于通常的细胞病毒分离。结论甲3型流感病毒环介导RT-LAMP检测方法,不仅快速特异、敏感性强,而且简便价廉,适于基层实验室使用。

荧光定量聚合酶链反应检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-1方法的建立

目的构建含有金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的重组质粒并以其为模板建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测TIMP-1的标准曲线,为荧光定量PCR准确检测TIMP-1奠定基础.方法提取大鼠星状细胞系HSC-T6的mRNA,经RT-PCR扩增TIMP-1基因后与pGMT-Vector 连接,转化到大肠杆菌DH5α,以筛选得到的阳性克隆质粒作为标准品进行梯度稀释,分别用Taqman荧光探针技术和SYBR Green I荧光染料技术进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对两者结果进行了对比.同时进行普通PCR检测,与荧光定量PCR方法检测结果进行比较.结果重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明pGMT-TIMP-1基因已成功克隆.以不同稀释水平的标准品质粒进行荧光定量PCR扩增, 应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线的线性检测范围为7×104～7×108拷贝,检测灵敏度为7×104拷贝;应用SYBR Green I荧光染料技术的线性检测范围为7×106～7×108拷贝,检测灵敏度为7×106拷贝,且熔解曲线显示出现非特异性扩增;两种技术相对于普通PCR技术均具有定量功能.结论所构建的pGMT-TIMP-1基因荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好, 灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为荧光定量PCR检测TIMP-1基因的标准方法.

c-myc基因在慢性粒细胞白血病患者中表达的意义

目的探讨c-Myc基因与慢性粒细胞白血病之间的关系。方法应用逆转录聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)技术检测30例CML(其中慢性期11例,加速期8例,急变期11例)和10例对照(正常骨髓6例和非恶性血液病4例)骨髓单个核细胞中c-myc基因的表达,分析c-myc基因与CML患者不同临床阶段之间的关系。结果 c-myc基因在CML不同临床分期的表达水平均有所升高,CML慢性期患者和对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05),CML加速期和急变期患者c-myc基因表达水平均明显高于慢性期和对照组(P<0.05),CML急变期患者较加速期患者c-myc基因表达水平更高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 c-Myc基因在CML加速期和急变期的表达明显升高,提示c-myc基因高表达可能是CML病情进展与急变的机制之一。c-myc基因表达水平在CML患者病程监测中具有重要意义,甚至可能作为c-myc基因抑制剂应用于CML的依据。

上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性及其各亚单位基因表达的研究

目的:探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在卵巢癌发生和发展中的作用,研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测66例卵巢上皮性肿瘤及10例正常卵巢组织端粒酶不同亚单位基因的表达情况,应用端粒重复序列扩增技术(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测其中45例卵巢上皮性肿瘤及9例正常卵巢组织端粒酶活性。结果:1)恶性、交界性卵巢肿瘤组织中端粒酶阳性检出率分别为83.33%(25/30)、71.43%(5/7),两组间无显著性差异(P>0.05),而良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢上皮中未检测到端粒酶活性,与前两组之间均有显著差异(P<0.001);2)RT-PCR定性检测发现hTR和TP1mRNA在检测的各组组织中均有表达,而hTERTmRNA主要在上皮性卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中表达,二者间hTERTmRNA表达的差别无统计学意义(P>0.05),而与良性及正常组织hTERT表达有显著差异(P<0.001);3)端粒酶活性与hTERT亚单位表达明显相关(P<0.001),而与hTR和TP1亚单位表达无明显相关性(P>0.05)。结论:端粒酶与卵巢癌发生发展过程密切相关;hTERT表达与端粒酶活性密切相关,并可能参与端粒酶的活性调节,hTERT的表达有望成为上皮性卵巢癌的诊断指标。

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。

山乌桕叶片DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

为研究南方优良乡土彩叶树种山乌桕的遗传多样性,并为山乌桕种质培育研究提供技术参考。以山乌桕叶片为试验材料,对山乌桕ISSR-PCR反应体系进行优化,比较试剂盒法、改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和十二烷基硫酸钠(SDS)法对山乌桕叶片DNA的提取效果,并利用单因素试验和L 25(53)正交试验对DNA模板用量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、退火温度和循环次数进行优化。结果表明,试剂盒法和改良CTAB法均可获得较高浓度和质量的DNA,都是提取山乌桕叶片DNA的良好方法;山乌桕叶片ISSR-PCR反应体系中,DNA模板用量对扩增效果影响最大,2×Taq Master Mix添加量的影响最小;山乌桕叶片ISSR-PCR的最优反应体系为:总体积20μL,其中含20 ng DNA模板1.5μL、2×Taq Master Mix 8.0μL、引物浓度0.8μmol·L^(-1)。山乌桕叶片ISSR-PCR的反应程序为:94℃预变性5 min、94℃变性30 s、51.9℃退火45 s、72℃延伸90 s、40个循环,72℃延伸10 min、4℃保存。

辽宁省乙型脑炎病毒分离及进化树分析

目的分离鉴定2007年辽宁省蚊虫携带流行型乙型脑炎(乙脑)病毒及基因型别。方法用细胞培养方法分离病毒,对致金黄色地鼠肾细胞系(BHK-21)细胞病变(CPE)的病毒进行逆转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)检测;扩增的目标片段进行序列测定;用Mega3.1软件、以邻位相连法构建进化树。结果共分离到22株病毒,RT-PCR检测结果表明,均为乙型脑炎病毒;随机选择其中3株病毒的基因序列进行基因型鉴定分析,均为Ⅰ型乙型脑炎病毒。3株病毒E基因编码结构域(Domain)区段分析结果显示,其核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和100%;与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有12个氨基酸位点变异。结论辽宁省蚊虫标本中分离的病毒均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,其中E基因所编码Domain区E-327(S→T)位点发生的变异,提示在辽宁省首次分离到乙型脑炎病毒变异株。

原发性肝癌组织中陷井受体3基因表达与扩增的临床意义

目的 观察原发性肝癌组织中陷井受体 3(DcR3)基因的表达和扩增 ,探讨该基因在肝癌组织中过度表达的原因 ,分析临床病理学因素在肝癌DcR3基因表达和扩增中的作用。方法 对4 8例病理学证实的原发性肝癌患者的组织 ,利用RT -PCR检测癌组织及癌旁组织DcR3基因mRNA表达 ,荧光定量PCR检测该基因的扩增倍数 ,统计分析肝癌组织中DcR3基因表达与扩增的相关性 ,比较不同临床病理学类型肝癌中该基因表达及扩增的差异。结果 4 8例肝癌组织中DcR3基因mRNA阳性表达 2 9例 ,阳性率为 6 0 4 % ;癌旁组织无阳性表达。mRNA表达与肿瘤大小、临床分期及肿瘤的浸润和转移有关 (P <0 0 5 )。mRNA阳性表达组的基因扩增倍数为 1 5 3± 0 82 ,阴性组为 0 75± 0 33,其差异有显著意义 (P <0 0 1)。 4 8例患者的DcR3基因扩增倍数为 0 18～ 3 86 ,平均值为 1 2 2± 0 77,扩增倍数超过 2的患者共 7例 ,占 14 6 %。不同扩增倍数肝癌患者该基因mRNA的表达差异有显著意义 (P <0 0 1) ;不同临床病理学特征肝癌间DcR3基因的扩增倍数差异无显著意义 (P >0 0 5 )。序列分析发现其mRNA序列与源序列有 3个碱基改变。结论 (1)原发性肝癌组织中存在DcR3基因的高表达 ,对应的癌旁组织中未见表达 ;(2 )

流感病毒核酸检测方法研究进展

流感病毒可以引起人和动物高度接触性传染性疾病,对公共卫生和畜禽养殖业均造成极大的威胁。因此,准确而又快速的诊断方法对流感的防控起着非常重要的作用。近年来,流感病毒的核酸诊断技术发展较快,主要有RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、基因芯片、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等。论文对这些诊断技术的基本原理和应用现状进行了综述,并对其发展前景进行了展望。

三种检测扎幌样病毒方法的比较分析

目的 比较三种常用检测扎幌样病毒的方法,以选取适合我国标本的较优检测方法。 方法 对收集到的169份粪便分别采用三种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行检测,扩增产物进行测序分析。 结果 方法A、B、C检测阳性标本数分别为3份(排出诺瓦克病毒阳性标本后)、4份、1份。4份PCR产物测序分析只有1份为扎幌样病毒,其余为轮状病毒。 结论 方法C特异性最好,即半套式RT-PCR优于其它二种RT-PCR方法。

膜显色DNA芯片技术检测丙型肝炎病毒基因型及临床意义

目的了解丙型肝炎病毒基因型分布及其临床意义。方法应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对89例抗HCV阳性血清进行HCVRNA扩增,再应用膜显色DNA芯片技术,对HCV进行基因分型,并对部分标本用基因测序法作对照。结果89份抗HCV阳性血清中,检测出HCVRNA阳性73例。其中,HCV/1b型66例(90.4%),HCV/1a型1例(1.4%),2a型3例(4.1%),3b型3例(4.1%)。13例标本作基因测序分型对照,分型结果完全一致。15例献血员血清中未检出HCVRNA。结论HCV/1b型是江苏常州地区丙肝病毒优势株。膜显色DNA芯片可用于HCVRNA检测及基因分型检测,方法简便、快速、准确,适合临床推广应用及流行病学研究。

实验兔出血症病毒检测方法的建立与免疫效果调查

目的检测全省六个实验兔场的兔子所携带的兔出血症病毒(RHDV)情况,调查实验兔RHDV抗体水平,评价不同疫苗的免疫效果,比较HAI与ELISA两种方法的符合率。方法采用HAI、ELISA方法对1168份实验兔RHDV抗体进行了检测,并与RT-PCR方法的检测结果进行对比分析。结果我省实验兔免疫情况较好,不同饲养场的实验兔免疫合格率虽有不同,但未发生疫情。通过比较发现ELISA法检测的抗体合格率明显高于HAI法。结论LISA、HAI和RT-PCR方法均适合实验兔RHDV的检测。

大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征(英文)

本研究采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和cDNA快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从大鼠A型精原细胞和粗线期精母细胞中成功克隆出大鼠泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme)基因Ube1(GenBank登录号EF690356)。该基因序列全长3433bp,其中开放阅读框有3171bp,编码一个含1057个氨基酸的蛋白质。Blast比对显示,Ube1与小鼠泛素激活酶基因Ube1y1的同源性为93%,与人泛素激活酶基因UBE1的同源性为82%。Ube1基因编码的蛋白质含泛素激活酶信号位点和泛素激活酶活化位点,这些位点也存在于人类和小鼠的泛素激活酶1中。RT-PCR分析显示,Ub e1在睾丸中大量表达,而在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、卵巢中没有表达。荧光定量PCR分析不同生精细胞中Ube1的表达,显示Ube1在A型精原细胞中大量表达,在粗线期精母细胞、圆形精子细胞和支持细胞中微弱表达。以上结果提示,Ube1是大鼠睾丸特异表达基因,可能通过参与泛素/蛋白酶体途径来影响精子发生。