双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

促纤维增生性小圆细胞肿瘤石蜡包埋组织中EWS-WT1融合转录子的检测

目的:探讨促纤维增生性小圆细胞肿瘤(DSRCT)石蜡包埋组织中EWS WT1融合基因表达的临床病理意义及其应用价值。方法:收集DSRCT石蜡包埋组织4例,原始神经外胚叶瘤/尤文肉瘤(PNET/ES) 2例,腺泡状横纹肌肉瘤2例,淋巴瘤2例,应用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测t( 11; 22 ) (p13;q12 )染色体易位融合基因EWS WT1的表达。结果: 4例DSRCT中有3例检测出融合基因的表达,对照组均没有检测出。结论:DSRCT石蜡包埋组织中检测EWS WT1融合基因的表达具有较好的敏感性和特异性,可作为临床病理诊断和鉴别诊断DSRCT的一个可靠的基因诊断指标。

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨

目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录 巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区域最小自由能与RT nPCR扩增效率的关系。结果 :4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段 ,但得到的PCR滴度有差异 ,D组引物所得滴度最高 ,B组最低 ;5 4份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低 ,B组的最高 ,与PCR扩增效率相关。结论 :在HEV基因组第 62 96～ 660 3核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本 ,扩增效率高 。

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

重组酶扩增技术概述及应用研究进展

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。

基于酶促恒温扩增技术快速鉴别天麻真伪检测方法的建立与应用

目的:基于酶促恒温扩增(enzymatic recombinase amplification, ERA)技术建立一种可快速定性鉴别道地药材天麻真伪的方法。方法:遵循ERA引物设计原则,应用Oligo 7.0软件根据天麻及其常见伪品的ITS2基因组序列,筛选优化天麻ERA特异性引物,应用Primer Premier 5.0软件设计天麻特异性PCR鉴别引物,通过对ERA、PCR反应体系的优化,最终确定ERA最佳反应时间为17 min,最适反应温度为40℃;PCR最优退火温度为57℃,循环为32次,对所建立的方法进行灵敏度、特异性验证,并选取中药市场市售天麻样品进行检测。结果:所设计的天麻ERA鉴别引物与其常见伪品间无交叉反应,特异性良好;重复性结果显示,3次重复性检测结果一致,未出现假阳性与假阴性;该方法对天麻基因组DNA的灵敏度为1 pg·μL^(-1),比传统PCR灵敏性高;ERA技术能够用于天麻市售样品的快速鉴定,且检测结果与PCR方法相同。结论:所建立的检测方法操作简单、快速,具有较高的特异性和灵敏度,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了一种新手段。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测基孔肯雅病毒方法的建立

目的建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)的基因检测技术方法.方法以CHIKV非结构蛋白1(non-structural protein 1,NSP1)基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合.利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性.结果在40℃恒温条件下,利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增,该方法最低检出限可达10拷贝/μL,且当CHIKV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性.结论成功建立一种可用于检测CHIKV NSP1基因的荧光RT-ERA法,该方法操作简便、检测限低且特异性好.

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革 1～ 4型病毒的多重逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革 1～ 4型病毒核酸序列设计多重RT PCR引物 ,并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性 ,随后对PCR反应条件进行优化 ,以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照 ,验证其特异性。并对 2 0 0 3年 30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测 ,阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革 1～ 4型病毒进行扩增 ,分别获得 2 95、2 37、118、347bp片段 ,与设计相符 ;而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带 ,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ,30份疑似患者血标本RT PCR扩增阳性率为 83.3% (2 5 / 30 ) ,其核酸序列与登革 1型病毒柬埔寨株以及中国 1997、1999年流行株GD14 / 97、GD0 5 / 99同源性分别为 97%、97%、98%。结论 实验证明 ,所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革 1～ 4型病毒 ,为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。

甲_3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用

目的建立适用甲3型流行性感冒(流感)病毒核酸检测的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法,为基层实验室流感快速诊断服务。方法对甲3型流感病毒设计两对环介导特异性引物与一个环引物,采用环介导RT-LAMP技术对甲3型流感病毒核酸进行等温扩增,并对反应体系进行优化。结果采用RT-LAMP技术检测甲3型流感病毒核酸,敏感度可达0.01TCID50/反应,与荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的敏感度相一致,且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应,具有良好的特异性。采用该方法检测58份临床样本,病毒分离的阳性率为37.9%,而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%,敏感度明显高于通常的细胞病毒分离。结论甲3型流感病毒环介导RT-LAMP检测方法,不仅快速特异、敏感性强,而且简便价廉,适于基层实验室使用。

酶促恒温扩增技术快速鉴定食品中牡蛎成分

目的:针对牡蛎建立基于酶促恒温扩增(Enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的快速检测方法。方法:基于NCBI上牡蛎线粒体的基因保守序列,通过Primer Premier 5.0软件设计5对ERA特异检测引物,并筛选出最佳引物。优化ERA反应的模板浓度、引物浓度、扩增温度和时间,最终获得最佳的反应体系,并进行灵敏度和特异性的验证,同时分别选取市场上几种牡蛎及其相关产品进行样本验证。结果:最终得出最佳ERA反应温度为39℃,最佳反应时间为20 min,优化后反应体系检测出牡蛎相关食品中的牡蛎成分灵敏度可达800 fg/μL,且特异性良好。结论:建立的检测方法具有操作简单、快速、不依赖于高端设备的优势,较高的特异性和灵敏度,为食品中牡蛎成分的快速、恒温、现场鉴定提供了一种新手段。

快速检测NDM-1基因的环介导恒温扩增技术的建立与评价

基于DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),探索建立一种应用于NDM-1基因(New Metallo-β-Lactamase-1 Gene,NDM-1)的快速检测方法,以适应临床实验室等的检测需求。利用LAMP技术,以NDM-1基因为靶序列,设计4组LAMP引物,并筛选最优引物组,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性实验。结果表明整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测实验结果。在灵敏度试验中,NDM-1基因的最低检测限为6拷贝/反应。在特异性实验中,以4株病原菌(肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌)以及肠道菌群元基因组DNA、土壤菌群元基因组DNA为模板对NDM-1基因进行检测,结果显示均没有发生非特异性扩增反应。文中建立的LAMP检测方法能够快速检测NDM-1基因,且可直接观察到实验结果,实现了检测结果的可视化。具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求,具有良好的应用价值。

依赖解旋酶恒温扩增技术快速检测麻疹病毒核酸

目的建立依赖解旋酶恒温扩增[Helicase-dependent Isothermal Deoxyribonucleic Acid(DNA)Amplification,HDA]技术快速检测麻疹病毒核酸。方法 在麻疹病毒的血凝素基因上设计特异性引物,采用逆转录-依赖耐热解旋酶恒温扩增(Reverse Transcription-therm ophilic HDA,RT-tHDA)技术进行恒温扩增,并对反应条件进行优化。结果采用RT-tHDA技术检测麻疹病毒核酸,对风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、肠道病毒71型、呼吸道合胞病毒均无交叉反应,具有良好的特异性;且最低检测限可达5.012×10-10摩尔/升(mol/L),敏感度与普通RT-聚合酶链反应方法 无明显差别。结论麻疹病毒RT-tHDA检测方法 具有简便、特异、敏感以及对仪器要求低的特点,为麻疹病毒的核酸检测,提供了一种新方法 。

上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性及其各亚单位基因表达的研究

目的:探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在卵巢癌发生和发展中的作用,研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测66例卵巢上皮性肿瘤及10例正常卵巢组织端粒酶不同亚单位基因的表达情况,应用端粒重复序列扩增技术(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测其中45例卵巢上皮性肿瘤及9例正常卵巢组织端粒酶活性。结果:1)恶性、交界性卵巢肿瘤组织中端粒酶阳性检出率分别为83.33%(25/30)、71.43%(5/7),两组间无显著性差异(P>0.05),而良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢上皮中未检测到端粒酶活性,与前两组之间均有显著差异(P<0.001);2)RT-PCR定性检测发现hTR和TP1mRNA在检测的各组组织中均有表达,而hTERTmRNA主要在上皮性卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中表达,二者间hTERTmRNA表达的差别无统计学意义(P>0.05),而与良性及正常组织hTERT表达有显著差异(P<0.001);3)端粒酶活性与hTERT亚单位表达明显相关(P<0.001),而与hTR和TP1亚单位表达无明显相关性(P>0.05)。结论:端粒酶与卵巢癌发生发展过程密切相关;hTERT表达与端粒酶活性密切相关,并可能参与端粒酶的活性调节,hTERT的表达有望成为上皮性卵巢癌的诊断指标。

逆转录－多聚酶链反应在虫媒病毒研究中的应用

本文重点介绍逆转录－多聚酶链在反应虫媒病毒诊断、鉴别诊断及媒介蚊监测中的应用。

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。

双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。

RNA恒温扩增-金探针层析法在肺炎支原体检测中的应用

目的:比较RNA恒温扩增-金探针层析法和荧光PCR法检测肺炎支原体的结果,探讨前者在肺炎支原体检测中的临床应用价值。方法:采用整体抽样的方法收集344例临床咽拭子标本,分别用RNA恒温扩增-金探针层析法和荧光PCR法进行检测,以荧光PCR法所得结果为参比,对检测结果进行统计分析。结果:RNA恒温扩增-金探针层析法阳性检出率13.08%,荧光PCR法阳性检出率12.79%,差异无统计学意义(χ2=0.0129,P>0.05)。RNA恒温扩增-金探针层析法与荧光PCR法相比阳性符合率为97.73%,阴性符合率为99.33%,总符合率为99.13%,一致性系数(Kappa值)为0.9613。结论:二者总符合率高,有相同的检出能力。在此基础上,RNA恒温扩增-金探针层析法作为一种创新方法,还具有操作简单、设备要求不高、结果判读明了等优点,因此该方法在肺炎支原体检测中有很强的临床应用价值。