吉林西部野生桔梗组培苗玻璃化逆转技术研究

为摸索野生桔梗不同外植体玻璃化苗的最适逆转条件,以野生桔梗种子无菌苗的子叶、胚轴、茎诱导分化不定芽过程中产生的玻璃化苗为研究对象,对6-BA、NAA、IAA三种激素不同浓度配比及培养基离子浓度进行筛选。结果表明,子叶逆转最适条件:1/4MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IAA+3%蔗糖+1%琼脂;茎及胚轴逆转最适条件:1/4MS+0.1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.1mg/L IAA+3%蔗糖+1%琼脂。

应用环介导逆转录等温扩增技术快速检测新城疫病毒

参考新城疫病毒融合基因(fusion gene,F gene)序列,设计了2对能够特异性地识别F基因上的6个区域的引物,并以此建立了一种简单、快速、有效的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法检测NDV.试验结果表明:该方法用时短(2 h内完成)、特异性好而且灵敏度高,最小检测限可达100 pg;对人工发病样品进行鸡胚分离和RT-LAMP检测,二者的阳性符合率高达93.5%;同时采用镁离子沉淀对检测结果进行可视化处理,方便利用肉眼直接观察.

利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

目的利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。方法针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab(ORF1ab)基因序列保守区设计引物,获得了RT-LAMP检测体系,并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。结果经检测新型冠状病毒核酸标准物质,其结果与预期相符,证实了该检测体系的可行性。结论利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高,适用于边境条件有限地区。

应用原位逆转录PCR技术检测Captopril对动脉粥样斑块中c-myc和c-fos mRNA表达的影响

目的 了解卡托普利对动脉粥样斑块中原癌基因 c- m yc和 c- fos m RNA表达的影响及原位逆转录 - PCR(IS-RT- PCR)技术在检测中的应用效果。方法 将 40只雄性日本大耳白兔随机分为对照组、胆固醇组及用药组 ,采用ISRT- PCR技术观察三组原癌基因 c- myc和 c- fos m RNA的表达及分布。结果 (1)胆固醇组的 c- m yc和 c- fosm RNA阳性率明显高于对照组 ,用药组则显著低于胆固醇组 ;(2 )主动脉粥样斑块中 c- m yc、c- fos m RNA呈强阳性反应 ,广泛分布于内膜层 ,阳性信号为核阳性 ;而用药组呈弱阳性反应 ,散在性分布。结论 提示卡托普利能显著抑制 AS斑块中原癌基因 c- m yc和 c- fos m RNA的表达 ,同时亦体现了 ISRT-

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。

逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒

目的建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法。方法针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较。结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,最低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2%。结论建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测。

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P>0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。

应用逆转录-环介导等温扩增技术检测乙型肝炎病毒RNA方法的建立

目的建立逆转录-环介导等温扩增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RTLAMP)方法检测乙型肝炎病毒(HBV) RNA,为乙型肝炎抗病毒治疗安全停药的研究提供技术支持。方法从NCBI数据库下载HBV A～D型,通过序列对比选出S区保守序列设计LAMP引物;提取HBV血清样本RNA与DNA,用RT-LAMP、LAMP进行检测;通过对非特异模板扩增实验验证扩增特异性;通过倍比稀释的HBV-RNA模板,用RTPCR法与RT-LAMP法检测以评价灵敏性。结果经过特异性实验证明LAMP特异性高,未检测到非特异性扩增。RT-LAMP的灵敏性为5×103IU/ml,RT-PCR的灵敏性为5×101IU/ml。用RT-LAMP与LAMP检测RNA与DNA证明了HBV-DNA检测不到后,HBV-RNA仍存在。结论本研究针对HBV S区保守序列,设计了针对我国主要的4种HBV基因型(A、B、C、D) LAMP通用引物,从而建立了检测HBV-RNA的RT-LAMP新技术,有助于为应用核苷类似物的乙型肝炎患者安全停药标志物的研究提供技术支持。

差异显示逆转录PCR技术及其应用和进展

差异显示逆转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术是一种筛选和克隆差异表达基因的新方法。该方法利用ｃＤＮＡ逆转录技术、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）的高效扩增和凝胶电泳分离技术，能同时显示多种来自相关细胞的ｍＲＮＡ样品。可用于多种研究目的，如鉴别和观察基因表达的改变；差异表达基因的迅速测序并与基因库比较；单个的差异表达基因片段能迅速克隆并制成探针从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中分离基因等。ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术具有迅速、简便、灵敏和高效等优点，已被广泛地应用于癌症、心脏疾病、细胞分化、衰老及其它领域的研究中，并且在应用中被不断地改进和发展而更趋合理和完善。

基于直扩RT-PCR技术的寨卡病毒快速检测方法的建立

目的建立基于直扩实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术的寨卡病毒快速检测方法。方法采用特殊功能的DNA聚合酶,以及优选PCR增强剂,以此建立直扩RT-PCR技术的寨卡病毒快速检测5种样本(全血、血清、唾液、咽拭子和尿)的方法。结果5种样本检测限分别为血清103 PFU/mL,尿、咽拭子和唾液102 PFU/mL,全血104 PFU/mL,标准曲线的拟合优度的可决系数均在0.98以上,扩增效率均在90%~110%;寨卡病毒核酸成功扩增,非寨卡病毒核酸均未能扩增;尿、全血和唾液样本的重复性实验中106 PFU/mL和102 PFU/mL两个浓度的6个重复Ct值的变异系数均<5%。该研究建立的直扩RT-PCR技术的寨卡病毒检测方法与常规RT-PCR技术的检测结果一致,8个寨卡病毒样本,均只检测出2个血清样本,其余62个非寨卡病毒样本及12个阴性样本均未得到扩增。结论成功建立基于直扩RT-PCR技术的寨卡病毒快速检测方法,该方法简便快捷且灵敏度高、特异度强。

单克隆抗体逆转多药耐药性研究进展

体外及动物实验发现抗P-糖蛋白单抗MRK_(16)、MRK_(17)等能与P-糖蛋白表达细胞膜表面的抗原决定簇结合,使P-糖蛋白构象改变,阻止药物外流,增加细胞内药物浓度。同时可通过免疫反应产生CDC和ADCC,杀伤耐药细胞。尤其是鼠人嵌合型抗P-糖蛋白单抗具有特异性好、细胞毒作用强和免疫原性低等特点。而且抗P-糖蛋白单抗与环孢菌素、IFN、脂质体包被药物等联合应用具有协同作用,为逆转MDR开辟了一条新的途径。

基于BSMOTE和逆转欠抽样的不均衡数据分类算法

针对传统分类器在数据不均衡的情况下分类效果不理想的缺陷,为提高分类器在不均衡数据集下的分类性能,特别是少数类样本的分类能力,提出了一种基于BSMOTE和逆转欠抽样的不均衡数据分类算法。该算法使用BSMOTE进行过抽样,人工增加少数类样本的数量,然后通过优先去除样本中的冗余和噪声样本,使用逆转欠抽样方法逆转少数类样本和多数类样本的比例。通过多次进行上述抽样形成多个训练集合,使用Bagging方法集成在多个训练集合上获得的分类器来提高有效信息的利用率。实验表明,该算法较几种现有算法不仅能够提高少数类样本的分类性能,而且能够有效提高整体分类准确度。

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察。整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应。本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术。

检测肠道病毒71型RT-LAMP技术的建立及其应用

目的为肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染的快速诊断建立一种简捷、敏感、特异的基因检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)。方法针对EV71VP1基因的8个区域设计6条特异性引物,建立检测该靶序列的RT-LAMP方法,对其特异性及敏感性进行了验证;并对手足口病患者标本进行检测,并与RT-PCR及Real-time PCR方法进行了比较。结果利用RT-LAMP方法能成功检测到EV71VP1基因区,等温条件下60min内即可完成检测,该方法简便快捷、敏感性高、特异性好;其阳性率高于RT-PCR方法(P<0.05),与Real-time PCR结果呈现很好的一致性(P>0.05)。结论 RT-LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作过程简捷快速,无需特复杂仪器等优点。适用于EV71感染的快速检测及分子流行病学的监测,具有很好的开发应用前景。

逆转录-环介导等温扩增快速检测EV71病毒

目的建立一种检测肠道病毒71型(EV71)快速、敏感的一步逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)方法。方法针对EV71病毒VP2基因特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其特异性和灵敏度。结果通过GoldView染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,且与柯萨奇病毒A16型(CA16)无交叉反应发生。所建立的RT-LAMP检测方法灵敏,最低检测限为1.0×102copies/mL。RT-LAMP检测的41份咽拭子标本中有27份出现EV71阳性反应,与荧光定量PCR结果一致。结论 RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、准确的方法,适合用于基层医疗机构临床检测。

双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。

新型冠状病毒检测技术的应用研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的准确诊断对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的临床管理和流行遏制至关重要。SARS-CoV-2的检测方法主要分为分子生物学方法和免疫学方法两大类。分子生物学方法是基于SARSCoV-2 RNA的检测方法,包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术、环介导等温扩增检测技术、成簇的规律间隔短回文重复序列技术和基因测序技术,灵敏度和特异度较高,其中RT-PCR技术是检测SARS-CoV-2感染的金标准。免疫学方法包括抗原检测技术、抗体检测技术、抗原抗体快速检测技术等,可以检测呼吸道分泌物中的病毒抗原,也可以检测血液中的抗体,操作简单、检测速度快,是分子生物学方法的有效补充。同时,基于生物识别和电化学信号的新型检测技术也在研发过程中。

RT-PCR技术在新型冠状病毒核酸检测的应用及质量评价分析

在新型冠状病毒感染患者的诊断中,采取有效检测方式进行及早诊断尤为重要。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术有较高灵敏度和特异度。本文分析临床应用RT-PCR技术检测新型冠状病毒的常见问题和应对策略,旨在为疫情防控常态化形势下临床实验室正确、高效开展新型冠状病毒检测提供参考意见。

寨卡病毒核酸检测技术研究进展

寨卡病毒(ZIKV)为黄病毒科黄病毒属的一种单链RNA病毒,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,也可通过血液、性、母婴等途径传播。传播ZIKV的蚊虫在我国分布广泛,同时,随着全球化的发展,世界各国人员往来日益频繁,ZIKV在我国有潜在传播的可能性。核酸检测技术是实验室快速检测的有效手段,对预防和控制ZIKV传播具有重要意义。本文介绍了ZIKV基因组结构,并对ZIKV核酸检测的样本特点及方法进展作一综述。

肺癌组织端粒酶亚基的表达及与端粒酶活性的关系

目的：探讨肺癌端粒酶各亚基的表达及与端粒酶活性的关系。方法：用ＴＲＡＰ法检测端粒酶活性，用逆转录 ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法检测肺癌组织、肺部良性瘤样病变和病灶旁非癌肺组织的 ＲＮＡ成分（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＲＮＡｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， ｈＴＲ）、端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， ｈＴＥＲＴ）、端粒酶相关蛋白 １（ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｈＴＥＰ1）各亚基的 ｍＲＮＡ表达，其结果与肺癌的组织类型、分化程度及ＴＮＭ分期进行了比较。结果：肺癌组织、肺部良性瘤样病变、病灶旁非癌肺组织端粒酶活性阳性率为８２％（４８／５９）、４３％（３／７）和２０％（７／３５）（Ｐ＜０．０００１），ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ表达阳性率分别为９１％（３３／３６）、７７％（７／９）、３５％（８／２２）（Ｐ＜０．０００１）。３组ｈＴＲ、ｈＴＥＰ１ ｍＲＮＡ普遍呈阳性表达，差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。肺癌不同细胞类型（鳞癌和腺癌）、ＴＮＭ分期和分化程度之间端粒酶活性、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ水平未见显著差异（Ｐ＞０．０５）。肺癌组织、肺部良性瘤样?