逆转录聚合酶链反应检测HCV RNA血标本保存条件分析

目的 确定用于丙型肝炎病毒 (HCV)RNA逆转录聚合酶链反应测定的血清 (浆 )标本的最佳收集和保存条件。方法 按设定的不同条件处理 ,用逆转录聚合酶链反应测定HCVRNA。结果 用高压消毒的离心管与未用高压消毒的离心管收集、保存HCVRNA血清 ,其阳性检出率有差异 (P <0 0 5 )。血凝固后 4h内离心分离血清对HCVRNA阳性检出率不造成明显改变 (阳性率为 85 % ) ;12h后检测则变化明显 (阳性率降至 75 % )。采用枸橼酸钠和EDTA K2抗凝剂的血浆管HCVRNA检出率分别为 90 %和 95 % ,显著高于血清管 (为 6 5 % )。反复冻融影响标本阳性检出率 ,标本在 - 2 0℃保存 3个月或半年几乎不影响检测结果。结论 收集和保存HCVRNA检测标本应尽量用EDTA抗凝管 ,在 4h内分离血浆 ;若用血清标本 ,最好在 4h之内分离血清 ,标本长期保存应分装且存放在 - 70℃。

逆转录聚合酶链反应检测结直肠癌淋巴结微转移的临床意义

背景与目的:结直肠癌淋巴结微转移灶是否有预测预后价值目前尚有争议,本文对结直肠癌患者淋巴结微转移情况进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测,研究微转移对临床分期和预后的影响。方法:用RT-PCR技术检测56例结直肠癌患者肠旁及系膜淋巴结中细胞角质蛋白CK20mRNA,揭示微转移灶的存在,并与常规病理苏木精伊红(HE)染色和免疫组化染色结果进行比较;分析HE染色和RT-PCR检测结果对判定临床病理分期和统计生存率的影响。结果:共检测432个淋巴结,HE染色、免疫组化染色和RT-PCR法淋巴结转移检出率分别为57.2%、62.3%和73.1%。HE染色和免疫组化的检出率无显著性差异(P>0.05),而HE染色和RT-PCR法检测结果有显著性差异(P<0.05)。56例患者中,按HE染色结果确定的PN0、PN1和PN2期,其5年无复发转移生存率分别为80%、60%和50%;通过RT-PCR技术检测,升级后的PN0、PN1和PN2期5年无复发转移生存率分别为100%、61.9%和55.6%,两种方法分析的结果有显著性差异(P<0.05)。结论:HE染色未确切指出淋巴结微转移癌;RT-PCR法检测CK20mRNA可以推断淋巴结微转移癌的存在,从而有助于确定结直肠癌临床分期和预测预后。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的 建立用多重逆转录聚合酶链反应 (mRT -PCR)检测甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒 (RSV)A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法 ,以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况调查。方法 采用经MDCK细胞接种培养的甲 3型、乙型流感病毒和Hep - 2细胞接种培养的RSVA型、B型标准毒株病毒液 ,以及甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒和RSVA型、B型混合毒株病毒液 ,使用 5组引物 ,分别为HA1- 5a1和HAl- 3a1(甲 1型流感病毒 )、HA3 - 5a1和HA3 - 3a1(甲 3型流感病毒 )、NP- 5b1和NP - 3b1(乙型流感病毒 )、RSVAF和RSVAR(RSVA型 )、RSVBF和RSVBR(RSVB型 ) ,经mRT -PCR ,琼脂糖凝胶电泳 ,于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果 甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒 ,RSVA型、B型分别在 43 1,2 10 ,3 90 ,3 3 4,183bp处出现清晰的 5条DNA条带。 结论 应用 5组引物 ,mRT -PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV ,并可对其进行分型 。

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带。巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致。该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA。初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段。

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒(英文)

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测。结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%。结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。

逆转录聚合酶链反应检测和鉴定疟原虫的研究

在同一反应体系中建立能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟及混合感染的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于现场采集血样检测。先以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计1对针对恶性疟原虫的特异性引物,建立RT-PCR检测恶性疟原虫方法,在此基础上,增加1条针对间日疟原虫的种特异性引物,使在同一反应体系中,能够同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段。恶性疟原虫和间日疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小为359bp和449bp特定扩增带,健康人血样和空白对照均未见扩增带。用建立的RT-PCR检测方法对现场采集128份血样进行检测,与镜检的阳性符合率为9609%,14份镜检为阴性的发热病人全血标本中2份RT-PCR检测为间日疟阳性。RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断中的建立

目的 运用逆转录 -半套式 -聚合酶链反应技术 (RT -semi-nested -PCR) ,建立一种新的早期快速检测乙型脑炎病毒的方法。方法 收集临床诊断的 37例乙脑和 15例非乙脑病人标本 (包括血清、脑脊液 )分别为 6 3份和 30份 ,同时用RT -semi-nested -PCR、IgM捕获法ELISA(MacELISA)进行检测。 结果 血清和脑脊液中可成功检测出JEVRNA ,经1 5 %凝胶电泳 ,出现特异性条带 ,符合预计值 4 0 0bp。结论 RT -semi-nested -PCR对检测JEV感染 ,从实验设计到实验条件 ,都是合理的 ,有较高的敏感性和特异性。可用于乙脑的早期诊断。

逆转录聚合酶链反应方法检测新生儿病房柯萨奇B_3病毒感染

目的:探讨逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法在检测柯萨奇病毒B3(CoxB3)感染中的作用。方法:采用RT-PCR方法对北京某医院31对(62例)疑似有母婴传播性CoxB3感染的新生儿和母亲血样进行CoxB3病毒的RNA检测。结果:62例样本经血清学检测,只有1例新生儿CoxB3病毒抗体阳性,阳性率为1.61%。经RT-PCR方法检测,62例血样中有12例检测结果为阳性,阳性率为19.35%;其中4对母、婴均阳性,2对新生儿阳性、母亲阴性,还有2对母亲阳性、新生儿阴性。其余23对母婴均为阴性。结论:RT-PCR法对于早期CoxB3感染检测的阳性率优于血清学检测方法,对确定病毒的传播途径有参考价值,同时可以早期预防病毒感染在新生儿中的爆发。RT-PCR法具有快速、敏感、特异性强等特点,是快速、有效检测CoxB3病毒感染的诊断方法之一。

用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的 探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法 建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果 优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论 为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。

逆转录聚合酶链反应用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应系统 ,用于检测恶性疟原虫感染。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段 ,设计一对特异引物 ,分别采用RT -PCR技术和PCR技术进行检测恶性疟原虫血样并比较两者检测的敏感性。结果 从培养的恶性疟血样中扩增出 35 9bp特定扩增带 ,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。检测系统初步显示可检出恶性疟血样中 0 34个疟原虫所含的RNA模板。以RNA为检测对象的RT -PCR肉眼可见条带的检测水平较以DNA为检测对象的PCR扩增高。结论 RT -PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点 。

用逆转录-聚合酶链反应检测乳腺癌患者骨髓微转移30例报道

目的 :通过分子生物学技术检测乳腺癌患者的微转移灶。方法 :患者常规行乳癌根治术 ,在完成皮瓣游离后 ,于胸骨柄处行骨穿 ,吸取骨髓 3～ 4ml,所采骨髓行RT -PCR检测其细胞角蛋白 19(KT19)含量。切除标本常规送病理。结果 :30例患者临床病理汇报同侧腋窝淋巴结转移阳性 17例 ,胸骨骨髓KT19阳性 7性 ,占4 1.12 % ,其中 3例肿块直径≥ 5 .0cm ,位于内乳内 ,临床未触及锁骨上淋巴结肿大 ;同侧腋窝淋巴结转移阴性13例 ,胸骨骨髓KT19阳性 3例 ,占 2 3.0 7%。总阳性率 33.33%。结论 :在术中游离皮瓣后于胸骨柄处进行骨穿获取骨髓 ,并转应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)检测细胞角蛋白 19(KT19)在胸骨骨髓中的表达 ,可以早期诊断乳腺癌的微转移。

逆转录聚合酶链反应检测结直肠癌淋巴结微转移

目的 探讨用逆转录聚合酶链反应 (reversetranscriptionpolymerasechainreaction ,RT PCR)检测结直肠癌淋巴结微转移 ,为临床肿瘤分期并制定合理的治疗方案提供指导性依据。方法 以CK2 0mRNA为标志物 ,应用RT PCR对 2 0例常规病理检查未检见淋巴道转移的结直肠癌及其所属 186枚淋巴结进行了检测。结果 有 8例 (4 0 % ) 5 4枚 (2 9 0 3% )淋巴结呈现阳性扩增 ,对照的非癌淋巴结呈阴性。结论 RT PCR是检测结直肠癌淋巴结微转移最敏感和特异的方法 ,具有广阔的应用前景。

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲１、甲３和乙型流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的ＨＡ基因的ＨＡ１片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果以流感病毒的ＨＡ基因为模板设计的三对引物，用多重逆转录聚合酶链反应能特异性地扩增出９４２ｂｐ、１１１７ｂｐ和 ７５１ｂｐ的核酸片段，它们分别和甲１、甲３和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感病毒。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。

粘蛋白基因逆转录聚合酶链反应法检测声门上型喉癌N0颈淋巴结微转移

目的 探讨检测颈淋巴结微灶转移的新途径 ,提高声门上型喉癌颈淋巴结微转移的检出率。方法 应用逆转录聚合酶链反应 (reversetranscriptionpolymerasechainreaction ,RT PCR)法 ,对 2 5例临床诊断为N0的声门上型喉癌行颈淋巴结清扫术 ,将取出的淋巴结行常规病理检查 (HE染色 )和粘蛋白 (mucin ,MUC1)基因mRNA检测。结果 2 5例颈淋巴结常规病理检查 (HE染色 )发现 6例有转移 (阳性率为 2 4% )者 ,RT PCR检测也为阳性 ;常规病理检查未发现转移的 19例中 ,RT PCR检测 4例阳性 ,其中 2例为颈淋巴结连续切片检查证实 ,另有 1例术后为转移癌病理证实。RT PCR检测的阳性率为 40 %。结论 MUC1基因RT PCR法检测颈淋巴结微转移较常规病理检查更敏感 。

逆转录-聚合酶链反应诊断IBDV的免疫后感染

用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对 5个养鸡场的 13份病死鸡腔上囊、腺胃标本进行了检测 ,诊断为免疫后感染传染性腔上囊病毒 (IBDV) 。

尿苷酶在丙型肝炎病毒逆转录-抗污染-联体聚合酶链反应中的应用

目的:建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)逆转录-抗污染-联体聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),并优化尿苷酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG)的抗污染剂量和抗污染时间。方法:逆转录-抗污染-联体PCR技术的第1次PCR实行逆转录-抗污染-PCR同步化;第2次PCR经分层蜡处理进行全程抗污染,并应用该技术扩增HCV cDNA,制备全含脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)的DNA(dU-DNA)为模板,作为UDG实验室抗污染质控对照并验证该联体PCR检测HCV RNA灵敏度,用DNA-酶免疫测定技术检测HCV cDNA。结果:抗污染实验结果证实,0.2u的UDG在37℃和42℃40min均可达到抗污染的效果。对高浓度全dU-DNA模板也有良好的抗污染效果。灵敏度检验结果表明,用HCV RNA浓度为2.110×105copies/mL的血清,稀释到10-4倍后仍可检测出HCV RNA。结论:应用该逆转录-抗污染-联体PCR技术进行全程抗污染,减少了因程序中多次加样造成的污染,为HCV逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测RNA提供良好的防污染和抗污染操作技术。