用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选。

一种用少量标本快速构建老年性白内障消减cDNA文库的方法

为从少量标本中获得含较多大片段的、高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用磁珠分离、生物素标记的改良消减杂交法获得差异cDNA ,利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,从而成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .在文库中随机挑取的 2 2个克隆中 ,10 0 0bp以上的片段有 7个 ,占 31 8% ,75 0bp以上有 15个 ,占 6 8 2 % .所得cDNA片段较大 ,可以满足下一步研究需要 .

利用TaqMan等位基因技术鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种

MEAM1和MED是烟粉虱Bemisia tabaci两种重要的外来入侵隐种,在我国部分地区常混合发生,对我国农业生产造成了不同程度的危害和损失。尤其是MED隐种危害寄主范围更广,对多种杀虫剂具有较高抗性,防治上更为困难。因此,如何快速鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种,对于烟粉虱防治策略的选择具有十分重要的意义。本研究选择线粒体细胞色素氧化酶I(mitochondrial cytochrome oxidaseI,mtDNACOI)基因保守区域内的单核苷酸多态性(SNP)为靶标,应用等位基因聚合酶链式反应技术,借助TaqMan-MGB荧光染色标记探针,建立了一种鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种的等位基因选择性PCR方法,并对北京11个区县的14个烟粉虱种群进行了隐种鉴定。结果表明,北京地区14个烟粉虱种群样本与已知烟粉虱MED隐种种群在荧光值分布上聚为一簇,为MED隐种。该鉴定方法具备SNP基因分型的优点,可快速、可靠、高通量地鉴定烟粉虱MEAM1和MED,为烟粉虱隐种鉴定及遗传分化研究提供了新的可选途径。

转化的大鼠胚胎成纤维细胞系差异表达基因的筛选研究

来源于转化的大鼠胚胎成纤维细胞系的两株细胞,A1-5细胞与B4细胞相比表现出非常强的抗辐射性并伴随不同寻常强的G2延迟效应;用PCR选择性抑制消减杂交方法对这两株细胞进行差减,希望找到对A1-5细胞表现出的不同寻常的表型起关键作用的某一个或某一些基因。结果得到了160个差减转化子,逐个进行序列测定,并进行Dotblot杂交,共得到35个差异表达基因片段(EST)。通过对美国国家生物技术信息中心(NCBI)的非冗余序列库(NT)、鼠EST库及人EST库的BLAST进行同源检索,发现其中21个代表了尚未登录的新基因,另外14个分别与已知基因高度同源。