透性化处理酵母工程菌提高虫草素发酵产量

以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C为底盘细胞,引入蛹虫草菌中虫草素合成关键基因cns1和cns2,成功构建了产虫草素的酿酒酵母工程菌COR12,经液体发酵10 d后虫草素产量达到(43.74±0.13)mg/L。采用细胞透性化技术,通过添加表面活性剂(吐温-60、吐温-80、SDS)、有机溶剂(乙醇、DMSO)、物理处理法(热激、超声、玻璃珠振荡)等改变细胞膜通透性,弱化胞内虫草素积累诱发的反馈抑制,促进胞内虫草素外排以实现虫草素高产。结果表明,在发酵第3天时添加0.4%SDS,7 d时虫草素发酵产量最高,达到(98.53±0.98)mg/L,较对照组提高366.30%。

有机溶剂透性化处理谷氨酸脱羧酶工程菌制备γ-氨基丁酸的研究

为了降低细胞壁和细胞膜的传质阻力对全细胞催化过程的不利影响,采用有机溶剂对表达重组谷氨酸脱羧酶(GAD)的工程菌BL21(DE3)-p ET28a-gad B进行了透性化处理。结果表明,菌体GAD表观催化活力的改善程度与有机溶剂的介电系数和疏水性具有较强相关性,低介电常数(<6),高疏水性(log P>0.68)的有机溶剂可以有效提高工程菌的GAD催化活性,其中最有效的透性化试剂为二甲苯(介电常数为2.4,log P为3.1)。当二甲苯的用量为5μL?mg?1(干重细胞)、处理时间5 min时,菌体表观催化活力达到最优值,为7.94 U?mg?1(干重细胞),是处理前表观催化活力的12.4倍。为了充分利用菌体的催化活力,采用海藻酸钙包埋的方法对二甲苯处理过的菌体进行固定化,结果发现固定化的透性化菌体可以较好地保持催化活力,反复催化10次后发现,第10次的GABA产率为第1次GABA产率的72.04%。研究为系统的选择有机溶剂来有效提高GAD工程菌表观催化活性提供了参考,同时制备的固定化的透性化菌体显示了良好工业应用前景。

透性化海藻糖合酶的研究

海藻糖是一种新型食品添加剂 ,目前其主要生产方法是利用微生物酶法合成。文章研究了在不易破壁取得胞内酶的情况下 ,采用渗透处理细胞技术生产透性化细胞酶的方法 。

透性化酪氨酸脱羧酶工程菌制备酪胺的研究

制备具有高表观酪氨酸脱羧酶(TDC)催化活力的全细胞催化剂对于酪胺生产效率的提升和成本的降低都至关重要。为此,研究构建了表达有Lactobacillus brevis CGMCC 1306 TDC基因的工程菌(Origami(DE3)-p ET21a-tdc),并在此基础上,采用9种有机溶剂对该工程菌进行透性化处理,来提高其菌体表观催化活力。结果表明,菌体表观TDC催化活力的改善程度与有机溶剂的疏水性具有较强相关性,高疏水性(log P>2.28)的有机溶剂能有效提高菌体表观TDC催化活力,最有效的透性化溶剂己烷的最适处理条件为:1%己烷处理工程菌10 min,在此条件下菌体细胞被膜结构发生明显改变,但细胞整体形态仍保持完整,菌体表观TDC催化活力可达1.48 U?mg-1。在pH 5.5,40℃的条件下,0.47 g?L-1透性化Origami B(DE3)-p ET21a-tdc菌体在4.5 h内可将18 g?L-1酪氨酸完全转化为酪胺。研究为系统地选择有机溶剂来提高TDC工程菌表观催化活性提供了参考,同时制备的透性化菌体显示了良好的工业应用前景。

透性化细胞海藻糖合成酶的制备及其催化合成海藻糖的工艺优化

笔者以麦芽糖为底物,开展经渗透细胞技术处理得到的透性化细胞海藻糖合成酶催化制备海藻糖的新工艺开发。首先,对比不同透性化试剂对异源表达海藻糖合成酶的大肠杆菌工程菌的透性化处理效果,发现使用硫酸粘杆菌素时海藻糖合成酶的催化转化率高达64.6%,是传统超声破碎的2.63倍;其次,通过参数优化获得硫酸粘杆菌素透性化处理的最佳条件,即:1.5 g/L的硫酸粘杆菌素在30℃下处理60 min,得到的海藻糖合成酶活性最高,为5 209 U/mL;最后,利用透性化处理后的大肠杆菌工程菌进行全细胞催化制备海藻糖工艺研究,结果表明:以质量分数25%的麦芽糖为底物,在pH 7.5、30℃条件下,获得海藻糖的转化率为65.6%;进一步通过离心收集细胞进行反复催化试验,在20批次之后,转化率仍维持在62.5%,显示了良好的应用前景。

基于乳酸克鲁维酵母的高纯度低聚半乳糖的扩试制备工艺开发

以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)为研究对象,开发了一套扩试制备高纯度GOS的工艺包,包括透性细胞p-cells催化反应、全细胞np-cells发酵纯化.在实验室反应阶段(25 mL),以单位酶活来定义加酶量,消除了以湿细胞浓度为准引起不同实验批次的结果偏差.PBS浓度从50降至5 mmol/L后,对GOS催化制备无影响,但大幅度降低了GOS产品盐含量.在扩试反应阶段(1 L),通过改进加料方式,将最佳反应时间缩短了4倍,消除了放大效应对反应速率的影响.对搅拌转速优化后可得最优条件(加酶量100 U/mL、PBS浓度5 mmol/L、转速400 r/min)下,GOS收率达到19.15%.在扩试纯化阶段(1 L),经优化可得最佳条件(总糖质量浓度100 g/L、全细胞添加量50 g/L)下纯化所得GOS粗液,经喷雾干燥,GOS纯度达到96.21%,未检测到杂糖,盐含量仅为3.79%,达到低聚糖国标要求.