构建表达猪卵透明带抗原(pZP3α)的重组乳酸杆菌

目的:构建表达猪卵透明带蛋白(pZP3α)的重组乳酸杆菌。方法:用PCR方法扩增得到短小乳酸杆菌染色体中的S-层蛋白的信号肽序列和猪卵透明带的pZP3α基因,并依次克隆到乳酸杆菌整合型表达质粒pIlac的lac启动子下游,得到质粒pIlac-pZP3α。将质粒pIlac-pZP3α电穿孔转化干酪乳酸杆菌(L.casei CECT5276),挑选转化后的耐药菌落,在含5μg/mL红霉素的MRS培养基中培养,抽提其基因组DNA做模板,PCR鉴定验证pZP3α基因是否整合到乳酸杆菌的基因组中。筛选重组菌在无红霉素选择压力下传代培养直至发生第2次重组使红霉素抗性基因消失。结果:酶切与测序结果表明信号肽和pZP3α基因正确克隆到载体pIlac中;PCR鉴定证实pZP3α基因成功重组到乳酸杆菌的基因组中,培养50 d后重组乳酸杆菌抗性消失,用斑点免疫印迹化学发光法检测到经终质量分数为0.75%乳糖诱导后的上清中有pZP3α蛋白分泌。结论:成功构建表达pZP3α的重组乳酸杆菌,pZP3α在乳酸杆菌中得到了稳定的、分泌表达。

重组猪卵透明带-3α抗原及其抗体的制备

目的:制备重组猪卵透明带-3α(rpZP3α)抗原及其抗体供发展避孕疫苗研究。方法:在2L发酵罐中接种毕赤酵母GS115-pZP3α工程菌,高密度发酵表达rpZP3α蛋白,表达的蛋白经螯合镍离子的亲和柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3α进行定量分析。rpZP3α免疫家兔,间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3α和猪卵透明带的抗体反应。IVF试验体外检测抗rpZP3α抗体对猪、小鼠精卵结合的影响作用。结果:工程菌高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,平均产量为8mg/L,用其免疫家兔获得抗rpZP3α抗血清,间接免疫荧光法分析显示此抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。体外精卵结合试验中,随着兔抗rpZP3α抗血清浓度的加大,其对猪、鼠精卵结合的抑制作用也增强。ELISA结果显示抗rpZP3α抗体与rpZP3α蛋白以及天然pZP3蛋白两种抗原反应的强度和趋势基本一致。结论:通过酵母体系制备的rpZP3α及其抗体具有免疫学活性。

避孕疫苗—展望与挑战

为了逐步提高我国人民的生活水平,控制人口已成为刻不容缓的关键任务。20多年来在我国已推行了许多控制生育的方法。这些方法是安全、有效的。对减少我国人口数量曾发挥过不可估量的作用。国外的经验虽然证明:依靠现有的方法完全有可能控制人口。但是我国20多年的经验表明:为了在2020年左右将我国人口控制在15亿左右,还需要采取其他新的措施。为控制我国人口,目前虽然在城市内主要应当减少人工流产率,但更重要的是要控制农村人口的增长。

自身免疫型卵巢早衰模型的研究

目的为了更好地建立自身型卵巢早衰模型,采用不同的造模时间和佐剂观察ZP3诱导的免疫型卵巢早衰模型建立的相关因素。方法将动情周期正常的B6AF1小鼠,随机分为正常组、模型A组、模型B组、模型C组、模型D组。造模结束后取小鼠血清检测性激素,取卵巢观察病理改变、透明带的变化、颗粒细胞的凋亡。结果除模型A组外,其余3组均表现出动情周期紊乱、高促性腺激素低雌激素、闭锁卵泡增多、透明带明显、卵巢凋亡细胞增多的现象,与各组相比模型C组和D组在闭锁卵泡数量、卵巢凋亡细胞和透明带的变化上更加明显。结论ZP3诱导可造成免疫型卵巢早衰,其中3次免疫的两组成模效果更好,成模率在80%,可作为今后建模的参考。