人卵透明带蛋白huZP3a^(22～176)和huZP3b^(177～348)肽段在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:探索将huZP3a22~348蛋白编码基因拆分成两段,分别表达的可行性,并研究表达产物的免疫原性。方法:用PCR技术, 将去N-端信号肽和C-端跨膜区的huZP322~348蛋白编码基因拆成大小相近的两段, 以完整阅读框的形式分别重组插入热诱导型pBV221的多克隆区。结果:大肠杆菌分别特异地表达了可单独或复合应用的huZP3a22~176和huZP3b177~348,在经过抗人ZP3不同抗原区合成肽抗体的蛋白印迹鉴定后, 用改良的制备性PAGE方法分离纯化这两种表达产物。同时用兔抗猪ZP IgGs蛋白印迹试验表明, huZP3a和pZP3b的几个共同线性抗原表位都存在于其肽链的前半区域。结论:通过基因重组技术可获得足够量的huZP3a和huZP3b,这为开展huZP3a和huZP3b的免疫原性以及huZP3诱发人精子顶体胞吐的功能域等研究奠定了基础。

重组人透明带蛋白3诱导精子的顶体反应

目的 :在体外条件下检测重组人透明带蛋白诱导的顶体反应。方法 :体外采集已生育健康男子精液 ,采用非连续密度梯度法分离精子 ,将获能的精子悬液分成阴性对照组 (C组 ,2 0 0 μL 精子悬液加 1μL DMSO)、阳性对照组 (A组 ,2 0 0 μL精子悬液加 A2 3187至终浓度为 10 μmol· L- 1 )和 ZP3组 (2 0 0 μL 精子悬液加 ZP3至终浓度为 10 m g· L- 1 ) ,考马斯亮蓝染色法检测重组人 ZP3蛋白诱导的顶体反应。结果 :C组、A组和 ZP3组发生顶体反应的精子百分率分别为 (5 .0 0± 1.70 ) %、 (4 6 .10± 7.4 9) %和 (13.2 0± 2 .70 ) % ,各组间比较差异有显著性 (P<0 .0 5 )。结论 :重组人透明带蛋白能够诱导人精子发生顶体反应。

重组人卵透明带蛋白3的制备及其免疫学活性分析

目的:纯化制备rhuZP3,并分析其免疫学活性。方法:在含重组质粒pGEX4T-1/huZP3的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,然后SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。rhuZP3免疫小鼠,ELISA法检测抗血清对rhZP3的抗体反应。结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhuZP3纯度达95%。而且它在ELISA鉴定实验中能被抗rhuZP3抗体识别。结论:通过原核表达系统制备的rhuZP3及其抗体具有免疫学活性。

兔透明带蛋白ZPB(RC55)DNA疫苗PCMV4-RC55的构建及其在兔的免疫反应

本实验以兔 ZPB作为免疫抗原 ,利用 DNA疫苗技术进行兔免疫避孕疫苗的研究。利用 Eco RI内切酶将 PGEM-RC5 5的兔 ZP基因 RC5 5亚克隆至 p Bluescript载体 ,再经 Hind III/ Xbal双酶切后 ,将 RC5 5基因构建至真核表达质粒载体 PCMV4,得到PCMV4-RC5 5。在 PCMV4-RC5 5 DNA疫苗免疫新西兰兔的实验中 ,设雌兔实验组及雄兔实验组 ,以 Bupivacaine-HCL为辅助剂进行大腿肌肉注射 ,2 4h后在相同部位注射 2 5 0μg PCMV4-RC5 5 DNA,并在第 4周免疫加强一次。分别于注射 PCMV4-RC5 5前及注射后第 2、4、5、6、7、8周耳静脉取血 ,收集血清 ,采用 EL ISA法检测新西兰兔产生抗 ZP-RC5 5抗体水平。检测结果表明 ,PCMV4-RC5 5 DNA疫苗能诱导雌兔和雄兔产生免疫应答 ,抗体滴度最高可达 1∶ 80 0 0 ,滴度维持在 1∶ 40 0 0水平能持续两个月以上。

重组人卵透明带蛋白(rhZP3)对人精子顶体反应的诱导作用

目的:观察重组人卵透明带蛋白(rhZP3)对人精子顶体反应的诱导作用。方法:正常生育力人精子经过获能后,分别用BSA、孕酮和含不同浓度的重组人ZP3蛋白的培养液共孵育,诱导精子顶体反应,对实验组和对照组的精子的顶体发生状态用考马斯亮蓝染色法进行评价。结果:精子与培养液共孵育30 min后,rhZP3组与BSA组之间差异有显著性(P<0.05),顶体反应率随rhZP3质量浓度增加而升高。结论:重组人ZP3蛋白对人精子顶体反应有显著的诱导效应,且在一定范围内与质量浓度成正相关,重组人ZP3蛋白具有发展精子顶体反应试剂盒的潜能。

人透明带蛋白3重组表达载体的构建与鉴定

目的 :构建高效表达人透明带蛋白 3的真核重组表达载体。方法 :利用 PCR、T- A载体克隆和亚克隆等技术。结果 :构建成 p GEM- ZP3重组质粒及 pc DNA3.1ZP3dhfr真核重组表达载体。结论 :经酶切鉴定构建的人透明带蛋白 3重组表达载体可高效表达重组人 ZP3蛋白。

人卵透明带蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人卵透明带蛋白(huZP3)基因原核表达载体。方法:利用PCR法扩增出含人卵透明带蛋白编码基因,先将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析,然后将huZP3蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pGEX4T-1上,酶切鉴定。结果:获得一个核苷酸长度约为1200bp的基因,同源比较结果表明,与GenBank(NCBI:M60504)公布的ZP3基因序列有100%的同源性。酶切表明ZP3基因正确插入原核表达载体pGEX4T-1。结论:成功构建出含ZP3基因的原核表达载体。

重组人卵透明带蛋白及其多克隆抗体对精子-透明带结合的影响

为了探讨毕赤酵母表达的重组人卵透明带ZP3蛋白(recombinant human zona pellucida-3 protein,rhZP3)及其多克隆抗体对小鼠和人精卵结合的影响,采用不同浓度的rhZP3以及空白培养液分别处理小鼠精子,然后再与小鼠卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附及体外受精率的影响;用rhZP3以及空白培养液分别处理人精子,然后再与人卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附的影响;用抗rhZP3抗体与阴性血清分别处理小鼠和人卵子,再与精子进行结合实验,观察多克隆抗体对精子粘附以及小鼠体外受精率的影响。实验结果表明,rhZP3和抗rhZP3多克隆抗体既能抑制人的体外精卵结合,也能抑制小鼠体外精卵结合,提示rhZP3具有天然透明带的特性,有发展成避孕疫苗和作为检测透明带抗体检测试剂的可能。

透明带蛋白及其在精卵结合中的作用

论述了透明带蛋白的起源、命名、组成结构、在精卵识别中的作用以及目前存在的问题和应用,并着重论述了透明带蛋白诱导顶体反应的机制。

哺乳动物卵透明带蛋白中C端furin位点存在的意义

根据已克隆的各哺乳动物物种卵透明带(ZP)三种蛋白质的cDNA序列推断,在它们编码的蛋白C端跨膜区上游几乎都存在RXK/RR基序。先前报道存在于许多蛋白C端的这一基序是furin蛋白酶的一个酶切位点。因此,为了阐明各ZP蛋白组份在分泌组装成ZP带时,是否在此furin位点经历了加工处理,以致丢弃它们C端的疏水性跨膜区,几个实验室相继从不同角度用不同方法进行了探讨。从目前的大多数实验结果来看,三个ZP组成蛋白分泌前在它们C端跨膜区上游的furin位点被切割的证据是充分的。当然也有相反的实验证明,即各ZP蛋白不经历此位点切割也能被分泌并进行ZP组装和扩张。对此截然相反的研究结果,一个可能的解释,也许是重组小鼠ZP3中分别选用了不同的表位标签和插入位置以及使用了不同的转染细胞株。

人透明带蛋白3真核表达载体的构建

目的构建人ZP3蛋白(从第23位到348位氨基酸)真核表达载体,用于在毕赤酵母中表达重组人ZP3蛋白。方法通过PCR方法扩增编码人ZP3蛋白的基因,并将其克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ构建真核表达质粒pPICZα-hZP3。结果经PCR扩增获得的hZP3基因大小为978 bp,其DNA测序结果分析表明:pPICZα-hZP3质粒上的基因片段与已知发表在Genbank上的人ZP3 cDNA序列一致。结论成功构建了含有人ZP3基因的真核表达载体pPICZα-hZP3。

哺乳动物卵透明带蛋白B细胞表位的研究进展

研制组合靶抗原B细胞表位和外源或自身“广谱性”T细胞表位的嵌合肽疫苗,正成为免疫学和疫苗学界新的分支领域。很清楚,构成其基础的是越来越多靶抗原B细胞表位的被鉴别。以小鼠、猪和人的卵透明带为重点,概述它们的B细胞表位研究进展,并兼顾介绍鉴定这些表位所用的主要方法和策略。

用人透明带蛋白(hZPA)N端重组肽的免疫避孕展望

哺乳动物卵透明带(ZP)是避孕疫苗可能的候选抗原之一。研究结果表明人ZPA重组表达蛋白在兔体内诱导了可抑制人体外受精的抗血清。本研究旨在确定该重组蛋白是否也能在一非人灵长类动物中产生可阻断受精的抗血清。 方法 免疫原使用了去除信号肽的猪ZPA氨基端198和人ZPA氨基端206个氨基酸残基肽,它们均山含各重组pET21b质粒的大肠杆菌(BL21)表达,然后被分别纯化用作抗原、帽猴的免疫采用完全福氏佐剂和单次为500μg抗原的背部两位点肌肉注射方式,在每次间隔1个月的4次加强免疫后收集抗血清。关于抗血清效价的鉴定,抗体生成的测定采用人卵母细胞免疫荧光染色法和酶联免疫吸附试验(ELISA)法,阻断受精试验使用人卵母细胞和精子。

人卵透明带蛋白3差异表达菌的鉴定及比较

目的:研究重组人卵透明带ZP3蛋白的差异表达情况。方法:构建8个重组rhZP3的差异表达质粒在毕赤酵母中进行诱导表达,研究跨膜区保留与否、潜在酶切位点突变与否及多聚组氨酸纯化标签设计的位置是否影响rhZP3的表达情况。结果:保留跨膜区会影响重组蛋白泌出胞外而使表达量降低,潜在酶切位点存在会导致重组蛋白被不完全降解,而多聚组氨酸纯化标签设计位置对表达也有一定影响。结论:从表达量和产物完整性综合考虑,以突变型成熟肽为佳,含跨膜区的蛋白则应选用pPICZaA质粒,以便富集得到完整的表达蛋白。

中药复方对卵透明带蛋白3表达的影响

目的:探讨中药复方对卵透明带蛋白3(zone pelluc ida3,ZP3)表达的影响。方法:用主动免疫法制作免疫性不孕小鼠模型,以中药复方进行治疗,治疗后采用ELISA法测定血清中抗ZP3Ab的分泌水平;采用免疫组化法检测中药复方在蛋白水平对ZP3基因表达的影响。结果:小鼠ZP3蛋白表达和血清中抗ZP3Ab水平灌胃组均较模型组降低(P<0.01)。结论:中药复方对大鼠ZP3蛋白表达和血清中ZP3Ab水平有抑制作用,对免疫性不孕具有很好的治疗作用。

重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达

利用P .pastoris表达人卵透明带ZP3蛋白。设计特定引物从全长hZP3cDNA上扩增含跨膜区序列的人卵透明带ZP3基因片段 ,并在N末端接上串联组氨酸编码序列的重组基因序列 ;扩增片段插入表达载体pPIC9K中 ;线性化后的重组质粒转入P .pastoris中 ,用高浓度G4 18筛选高拷贝菌株 ,然后甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果发现P .pastoris表达的人ZP3蛋白可以分泌到培养液中 ,并且可溶性好。纯化前后的重组人ZP3蛋白均能与兔抗猪ZP3蛋白抗体发生交叉反应 ,证实表达的目的蛋白具有反应原性。

哺乳动物透明带糖蛋白研究进展

哺乳动物的精卵识别是通过精子表面糖蛋白和透明带 ( ZP)糖蛋白的特异性识别完成的 ,这两种糖蛋白结构互补。透明带糖蛋白有三种成分 ( ZP1 、ZP2 和 ZP3) ,其中 ZP3被认为是第一精子受体 ,能与顶体完整的精子结合 ,并诱发顶体反应 ( AR) ;ZP2 是第二精子受体 ,与发生 AR的精子结合 ;ZP1 只起连接ZP2 和 ZP3的作用。用 ZP糖蛋白免疫哺乳动物可造成卵巢功能早衰 ( POF) ,ZP-α.β作为异种载体蛋白诱发的抗体能阻断精卵结合 ,在精卵结合早期起抗生育的作用。

猪卵透明带-4蛋白在大肠杆菌中高表达的研究

目的：在大肠杆菌中高水平地直接表达目的蛋白。方法：用PCR方法从猪卵透明带-l（pZP1）cDNA中扩增pZP4目的基因片段，通过在其5'端和3'端引入的双酶切位点将该完整的目的cDNA定向插入pBV221表达质粒PRPL启动因子下游的多克隆区。结果：此重组表达质粒转化宿主工程菌后经热诱导培养，可在SDS-PAGE凝胶上得到特异性的高表达蛋白条带，而且它在 Wistem blot鉴定实验中能被鼠抗pZP4的单克隆抗体17D3和兔抗pZPIgGe识别。结论：成功地在大肠杆菌高效表达了可被17D3单克隆抗体及ZP多克隆抗体识别的ZP4。

人卵透明带3蛋白的二级结构和B细胞抗原表位预测

目的：预测并综合分析人卵透明带3（human zona pellucida 3,hZP3）蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位。方法：以hZP3蛋白的基因序列为材料,采用Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测其结构蛋白的二级结构及蛋白骨架区的柔韧性,采用Kyte-Doolittle法对蛋白的亲水性进行分析,Emini法预测蛋白的表面可能性,Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数。结果：hZP3蛋白含有较多的β折叠和转角结构。该蛋白第27～31、36～46、114～133、140～151、237～240和324～329区段可能是α-螺旋中心;hZP3蛋白分子第52～54、60～67、74～78、100～111、158～169、181～185、190～193、210～218、226～229、311～317、335～349和353～360区段可能是β-折叠中心。hZP3蛋白具有多处抗原指数较高的区段,其中近中部区段和近羧基端的第92～95、132～137、171～178、239～245、252～255、279～286、292～305和319～324区段含有潜在的B细胞优势抗原表位。结论：以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段,用抗原指数、亲水性参数和表面可能性参数预测hZP3蛋白的B细胞抗原表位,为实验确定hZP3蛋白的B细胞抗原表位并以此进行免疫避孕研究奠定基础。