透明质酸合成酶2通过调控TGF-β/SMAD4信号通路对肾细胞癌发生发展的影响

目的探讨透明质酸合成酶2(HAS2)在肾细胞癌(RCC)中的作用及其潜在分子机制。方法收集我院从2019年8月至2021年7月收治的RCC患者接受手术切除的30例RCC组织(RCC组)和30例癌旁组织(NAT组),RT-qPCR和Western blot实验分别检测HAS2 mRNA和蛋白在RCC组织和细胞中的表达。将NC-siRNA、HAS2-siRNA转染至细胞后,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测RCC细胞的活力;流式细胞术检测RCC细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞迁移情况;Western blot检测RCC细胞中上皮-间充质转化(EMT)标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白和凋亡蛋白标志物Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白以及TGF-β1、p-Smad4蛋白的表达。结果与NAT组比较,RCC组织中HAS2 mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05);与正常肾近端小管上皮细胞(RPTEC)比较,RCC细胞系中HAS2 mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)。与Control组比较,HAS2-siRNA组细胞中HAS2 mRNA和蛋白水平显著降低,细胞增殖和迁移能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Bax和Caspase-3蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低,E-cadherin蛋白水平显著升高,N-cadherin和Vimentin蛋白水平显著降低,TGF-β1、p-Smad4蛋白水平均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。NC-siRNA组与Control组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉默HAS2能抑制肾细胞癌细胞增殖、迁移和EMT,促进肾细胞癌细胞凋亡,其机制可能与调控TGF-β/SMAD4信号通路有关。

脑胶质瘤组织中透明质酸合成酶2表达变化及其与临床病理参数和预后的关系

目的观察脑胶质瘤组织中透明质酸合成酶2(HAS2)的表达变化,探讨HAS2表达与脑胶质瘤临床病理参数及预后的关系。方法收集行脑胶质瘤切除术患者的胶质瘤组织标本70例纳入病例组,肿瘤WHO分级1~2级32例、3~4级38例。另收集同期行颅内减压术的脑外伤患者的脑组织标本10例纳入对照组。分别采用免疫组化法及Western blotting法检测两组HAS2蛋白,分析HAS2表达与脑胶质瘤临床病理参数的关系。采用Logistic回归分析胶质瘤组织中HAS2表达量的影响因素。绘制Kaplan-Meier生存曲线,比较不同HAS2表达水平的脑胶质瘤患者的预后。结果免疫组化检测结果与Western blotting检测结果均显示,病例组HAS2表达高于对照组,且3~4级脑胶质瘤组织中HAS2表达高于1~2级脑胶质瘤组织(P均<0.05)。WHO分级3~4级、突变型p53、Ki-67高表达脑胶质瘤组织中HAS2高表达率分别高于1~2级、野生型p53、Ki-67低表达的肿瘤组织(P均<0.05)。将WHO分级、Ki-67表达、p53分型、年龄、性别、肿瘤部位和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶表达作为自变量,将HAS2表达作为因变量,纳入Logistic回归模型分析,结果显示WHO分级、Ki-67表达与p53分型是脑胶质瘤患者HAS2表达的独立影响因素(P均<0.05)。HAS2高表达患者的平均生存时间、总生存率低于HAS2低表达患者(P均<0.01)。结论HAS2在脑胶质瘤组织中高表达,HAS2高表达与脑胶质瘤恶性程度有关,并影响患者预后。

透明质酸对体外培养的大骨节病和骨关节炎软骨细胞透明质酸合成酶2 mRNA表达的影响

目的对体外培养的人大骨节病和骨关节炎软骨细胞添加不同剂量透明质酸,观察干预前后软骨细胞透明质酸合成酶2(HAS2)mRNA的变化。方法选取2006年8月—2008年7月陕西地方病研究所明确诊断大骨节病,并实施膝关节游离体摘除术后取出游离体及关节软骨6例为大骨节病组;西安市红十字会医院明确诊断骨关节炎,并行全膝关节置换术后的膝关节软骨6例为骨关节炎组;另选择同时期由于意外车祸等原因截肢或身亡者的新鲜膝关节软骨6例为对照组。对3组软骨细胞采用不同剂量的透明质酸进行干预,分为0μg/ml(H0)、100μg/ml(H100)、500μg/ml(H500),通过RT-PCR法观察透明质酸对3组软骨细胞HAS2 mRNA表达的影响。结果干预前3组HAS2 mRNA表达比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中骨关节炎组较对照组降低(P<0.05)。干预后3组不同剂量间HAS2 mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论退变的大骨节病和骨关节炎软骨细胞合成透明质酸能力下降;应用外源性透明质酸后,有增加软骨细胞自身透明质酸合成的趋势,为透明质酸关节腔注射治疗大骨节病及骨关节炎提供了理论基础。

透明质酸合成酶的研究进展

人类透明质酸合成酶 (Hyaluronansynthase ,HAS)是一类在透明质酸 (Hyaluronicacid ,HA)合成过程中发挥重要作用的酶 ,可分为HAS1、HAS2、HAS33种。这 3种合成酶均可催化合成相当水平的透明质酸 ,且在特定的生理和病理过程中有所表达。但是 ,不同的透明质酸合成酶在稳定性、活性、催化产物HA的分子量等各方面也存在着明显差异。文章就人类 3种透明质酸合成酶 (HAS1、HAS2、HAS3)的分子特征、生物学活性、临床应用以及目前研究中存在的问题等研究情况进行综述 。

马链球菌透明质酸合成酶基因的分子克隆及表达

根据Streptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis三种链球菌透明质酸合成酶(seHAS、spHAS、suHAS)基因的高度保守区，设计一对简并引物，用两次PCR从Streptococcus equi的总DNA中扩增出sqHAS基因。构建表达质粒pSE-sqHAS并转化大肠杆菌DH5α，诱导培养后在细胞膜中检测到sqHAS蛋白及活性。利用携带该酶的细胞膜以UDP-GlcA和UDP-GlcNAc为底物在体外合成了分子量为3.6×10~6Da的HA，分别是发酵法生产和提取法生产的HA的分子量的2.5倍和5倍左右。马链球菌透明质酸合成酶基因的克隆及表达，国内外文献尚未见报道。本研究为体外酶法生产透明质酸做了初步探索。

甲状腺相关眼病眼眶组织透明质酸合成酶表达的研究

目的探讨透明质酸合成酶2(HAS2)mRNA在甲状腺相关眼病(TAO)患者球后脂肪组织及眼外肌中的表达。方法收集四川大学华西医院眼科2000—2005年确诊并行眼眶减压术或斜视矫正术的TAO患者21例为TAO组,获得眼外肌标本18个,脂肪标本17个;Ⅱ期义眼台植入患者、眼袋整形者及共同性斜视患者18例作为对照组,共获得眼外肌组织标本17个,脂肪组织标本11个。所有标本通过原位杂交的方法,测量吸光度(A)值,计算HAS2mRNA的表达。依据活动期的临床表现对TAO患者进行临床活动性评分(CAS),采用Spearman秩相关分析对HAS2mRNA在待测眼组织标本中的表达量与TAO患者CAS的相关性进行评估。结果 TAO组患者眼外肌和脂肪间质组织HAS2明显黄染,对照组均呈轻度黄染。TAO组和对照组的眼外肌组织中HAS2mRNAA值分别为191.133±48.898和133.200±48.933,差异有统计学意义(P=0.001)(95%CI:24.275～91.590);TAO组和对照组眶脂肪组织中HAS2mRNAA值分别为50.430±26.812和33.048±11.690,差异有统计学意义(t=2.350,P=0.028)(95%CI:2.099～32.664);CAS与TAO脂肪组织中HAS2mRNA的表达无明显相关性(r=0.044,P=0.868),与肌肉组织中HAS2mRNA的表达呈弱正相关性(r=0.496,P=0.036)。结论 TAO患者HAS2mRNA的高表达是造成眶后透明质酸堆积的原因之一。

不同分子量透明质酸对人腹膜间皮细胞透明质酸合成酶mRNA表达的影响

目的 :了解不同分子量透明质酸对人腹膜间皮细胞透明质酸合成酶 (HAS)的调节作用及对透明质酸合成的影响。方法 :分离培养的人腹膜间皮细胞 (HPMCs)随机分为 3组 :正常对照组 (对照组 ) ;高分子量透明质酸组(分子量为 1,6 0 0 ,0 0 0道尔顿 ,浓度 0 .0 1%,HHA组 ) ;低分子量透明质酸组 (分子量为 2 80 ,0 0 0道尔顿 ,浓度 0 .0 1%,LHA组 )。给予上述刺激后继续培养 2 4h后 ,以RT -PCR法检测HAS - 2mRNA和HAS - 3mRNA的表达 ;微粒排除法观察细胞基质的面积。结果 :LHA组HAS - 2mRNA及HAS - 3mRNA表达均较对照组增强 (P值均 <0 .0 5 ) ;HHA组HAS - 2mRNA表达较对照组增强 ,而HAS - 3mRNA表达与对照组无显著差异。各组细胞胞衣样结构面积与细胞体面积的比值的比较 ,HHA组较对照组有增加趋势 ,但未达统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,LHA组与对照组间无显著性差异。结论 :LHA和HHA均促进HPMCsHAS - 2mRNA表达 ,LHA对与炎症反应相关的HAS - 3mRNA表达也有增强作用 ,而HHA则没有这一作用。因此 ,从选择腹膜保护剂的角度分析 ,我们倾向于选择更具生物相容性的HMW -HA。

渗透压制剂对人腹膜间皮细胞透明质酸合成酶的调节作用

目的 :了解不同渗透压制剂对人腹膜间皮细胞 (humanperitonealmesothelialcells,HPMCs)透明质酸合成酶 (hyaluronansynthase ,HAS)的调节作用及对透明质酸 (hyaluronan ,HA)合成的影响。方法 :分离培养的HPMCs随机分为 5组 :正常对照组 (对照组 ) ;90mmol/L葡萄糖组 (高糖组 ) ;30mmol/L葡萄糖组 (低糖组 ) ;5 %缩合葡萄糖 (缩合葡萄糖组 )及 90mmol/L甘露醇组 (甘露醇组 )。给予上述刺激后继续培养 2 4h ,以RT -PCR法检测HAS - 2mRNA和HAS - 3mRNA的表达 ;收集细胞培养上清液 ,以放射免疫法检测HA浓度 ;以微粒排除法观察细胞胞衣样结构的面积。结果 :高糖组、低糖组、缩合葡萄糖组、甘露醇组HAS- 2mRNA的表达均显著高于对照组 (P均 <0 0 5) ;高糖组HAS - 3mRNA的表达亦明显增加 (P <0 0 5) ,低糖组、缩合葡萄糖组、甘露醇组HAS - 3mRNA表达与对照组相比差异无显著 (P >0 0 5)。各实验组细胞胞衣样结构面积与细胞体面积的比值无显著差异 (P均 >0 0 5)。对照组、高糖组、低糖组、缩合葡萄糖组、甘露醇组细胞培养上清液HA的浓度均显著高于对照组 (P均 <0 0 5) ;高糖组HA浓度显著高于低糖组、缩合葡萄糖组和甘露醇组 (P <0 0 5)。结论 :与高浓度葡萄糖相比 ,缩合葡萄糖虽增强HPMCsHAS - 2mRNA表达 ,?

透明质酸合成酶基因在甲状腺相关眼病患者和正常人眼眶结缔组织中的表达

目的探讨3种透明质酸合成酶基因(HAS)在甲状腺相关眼病(TAO)患者和正常人眼眶结缔组织中的表达。方法收集14例TAO患者(TAO组)和8例正常人(对照组)眼眶结缔组织标本,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测HAS1、HAS2和HAS3的mRNA表达水平。结果3种HAS基因mRNA在TAO患者和正常人眼眶结缔组织中的检出率相当,差异无显著性意义(P>0.05)。其中,HAS3在全部组织块中检出,HAS1在TAO组为64.3%,对照组为50%;HAS2在TAO组为21.4%,对照组为37.5%;TAO患者眼眶结缔组织HAS3基因表达量为正常人的4.5倍(P<0.01)。结论HAS1和HAS3基因mRNA在TAO患者眼眶结缔组织的大量表达,可能是TAO患者眼眶局部组织中透明质酸增加的分子基础。

大鼠透明质酸合成酶-2抗血清的制备及鉴定

目的:制备大鼠透明质酸合成酶-2(HAS-2)抗血清并鉴定抗血清灵敏度及其特异性。方法:通过生物信息学分析选取HAS-2非保守的亲水区域作为抗原,通过原核表达纯化后免疫家兔,制备出抗血清。Western blot检测所制备抗血清的灵敏度。真核瞬时表达大鼠HAS-2和HAS-3,分别用抗His抗体和抗血清检测,鉴定制备抗血清的特异性。结果:通过原核表达并纯化得到抗原多肽,免疫家兔后获得ELISA效价大于1∶10000的抗血清。所制备的抗血清至少可以检测出10ng以上的抗原多肽,并且能够特异地检测HAS-2而与HAS-3无反应。结论:成功通过大鼠HAS-2非保守区域多肽的原核表达产物制备出高灵敏度和特异性的大鼠HAS-2抗血清,为研究透明质酸(HA)的病理生理意义提供了有利支持。

大鼠透明质酸合成酶-3基因真核表达载体的构建及趋化作用研究

目的:构建透明质酸合成酶-3(hyaluronan synthase-3)真核表达载体,转染真核细胞并检测重组蛋白酶活性。方法:提取损伤大鼠坐骨神经总RNA,RT-PCR扩增HAS-3编码框cDNA,构建于真核表达载体pcDNA3.1D中,并亚克隆到荧光载体pEGFP-N1中。将构建好的质粒转染大鼠施旺细胞RSC96,检测HAS-3的表达及酶活性。研究转染细胞培养上清对巨噬细胞的趋化作用。结果:HAS-3真核表达载体pcDNA3.1D-HAS3及pEGFP-HAS3测序结果显示片段插入正确,序列与GenBank公布数据一致,转染RSC96细胞并检测到重组蛋白的表达和酶活性,过表达HAS-3细胞的培养上清对巨噬细胞的趋化作用显著高于未转染细胞上清。结论:成功地构建HAS-3真核表达载体且真核表达的重组HAS-3具有合成HA活性,HAS-3过表达培养上清能趋化巨噬细胞,在体内可能参与到炎症反应中。

RNAi阻断人膀胱癌组织中成纤维细胞内透明质酸合成酶3的表达研究

目的探讨RNA干扰技术阻断人膀胱移行细胞癌组织中成纤维细胞内透明质酸合成酶3(hyaluronicacidsynthase3,HAS3)的表达与膀胱移行细胞癌生物学行为之间的关系。方法设计、体外化学合成HAS3mRNA序列特异性、非特异性小干涉双链RNA(smallinterferencingRNA,siRNA),分别与脂质体LipofectamineTM2000结合后转染体外培养的人膀胱移行细胞癌组织中的成纤维细胞。实验分为A、B、C、D四组:孵育48h后,取各组细胞培养液进行放免法透明质酸浓度测定、免疫细胞化学染色了解透明质酸的合成、RT-PCR法检测HAS3mRNA的表达。结果与A组相比,D组细胞HAS3mRNA表达减少了78.2%,HA染色明显变淡,细胞培养液中HA浓度下降了60.3%(P<0.01);B、C组mRNA表达分别减少了4.7%、5.4%,HA染色几乎无变化,HA浓度分别下降了5.2%、5.8%(P>0.05)。结论RNA干扰技术可以显著地减少膀胱移行细胞癌组织中成纤维细胞的HAS3的表达,从而大幅度地降低该细胞内透明质酸的合成。

可溶性CD40L促进甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞增殖和透明质酸合成酶表达

目的 探讨可溶性CD40L（sCD40L）对甲状腺相关性眼病（TAO）患者眼眶成纤维细胞（OFs）增殖和3种透明质酸合成酶（HAS）mRNA表达水平的影响,初步探讨sCD40L在TAO发病中的作用。方法 取5例TAO患者和3例正常对照标本原代培养OFs,采用MTS比色法检测终质量浓度6.25、12.5、25、50、100、200ng/mL的sCD40L作用48h后对不同来源OFs增殖的影响;实时荧光定量PCR技术检测终质量浓度12.5、25、50、100ng/mL及作用3、6、12、24h后的sCD40L对不同来源OFs的3种HAS基因（HAS1~3）表达水平的影响。结果 25ng/mL及以上浓度的sCD40L作用48h后对TAO患者OFs有促增殖作用（P〈0.05）;而50ng/mL及以上浓度的sCD40L作用48h后才能对正常对照OFs有促增殖作用（P〈0.05）,且作用较弱。TAO患者OFs中HAS3mRNA的合成在sCD40L的刺激下增加,并且呈现出浓度和时间依赖的趋势。结论 sCD40L能够促进TAO患者OFs的生长以及HAS3基因的表达,提示sCD40L在TAO的病理过程中起一定作用。

透明质酸合成酶2真核表达载体的构建及表达

构建了透明质酸合成酶2真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达。利用RT-PCR法从MG63细胞总RNA中扩增,获得人透明质酸合成酶2cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-N3,将经双酶切鉴定和DNA测序证实的阳性重组子命名为pEGFP-N3-HAS2。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。双酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pEGFP-N3-HAS2真核表达载体。转染HEK293细胞后可见HAS2-EGFP融合蛋白高表达并定位于浆膜。该载体的成功构建为进一步探讨透明质酸合成酶2在治疗骨性关节炎、修复关节软骨缺损中的应用价值奠定了基础。

内淋巴囊上皮细胞透明质酸合成酶mRNA的表达

目的 研究内淋巴囊上皮细胞透明质酸合成酶 (hyaluronansynthase)mRNA的表达及其意义。方法 在查阅核酸序列数据库基础上 ,采用Motif程序分析各物种 (大鼠、小鼠、爪蟾、人类 )透明质酸合成酶的保守序列 ,应用原位杂交技术检测透明质酸合成酶mRNA在内淋巴囊上皮细胞的表达。结果 内淋巴囊近侧端、中间部均有部分上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性表达。结论 在分子生物学水平证实了内淋巴囊上皮细胞能合成透明质酸。

肝癌组织中透明质酸合成酶家族差异表达的临床意义

目的研究透明质酸合成酶(HAS)家族基因在肝癌组织中的差异表达情况,并探讨其潜在的临床意义。方法采用免疫组织化学方法,检测94例肝癌组织和24例正常人肝组织中各HAS亚型的蛋白表达。分析HCC组织中各HAS亚型蛋白表达与临床病理特征的关系。结果 95例肝癌组织中,HAS1、HAS2和HAS3的阳性表达率分别为54.4%(51/94)、77.7%(73/94)和56.4%(53/94),其中HAS1和HAS2、HAS2和HAS3的蛋白表达差异有统计学意义(P=0.004,P=0.001),而HASl和HAS3的蛋白表达差异无统计学意义(P=0.654)。HAS1蛋白表达与肿瘤发病、T分期和病理分级有关,HAS2蛋白的表达与肿瘤大小有关,HAS3蛋白表达与各临床病理特征无关。结论 HAS各亚型蛋白肝癌异常高表达,可能与肿瘤的发生、发展有密切关系,是肝癌生物治疗潜在的靶点。

透明质酸及其合成酶在炎症牙髓组织中的表达

目的检测透明质酸(HA)及其合成酶(HAS1、HAS2、HAS3)在炎症牙髓组织中的表达,为研究其在牙髓组织炎症调控过程中的作用提供依据。方法牙髓组织来自健康患者完全埋伏阻生及萌出后因深龋致牙髓炎症的第三磨牙,采用免疫组织化学(IHC)及免疫荧光(IF)染色法检测所取牙髓组织中HA、HAS1、HAS2、HAS3及肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达,用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对HAS1、HAS2、HAS3及相关炎症因子IL-6、IL-8、TNFα在健康及炎症牙髓组织中的表达情况进行定量检测。结果IHC及IF染色结果表明,HA、HAS2、HAS3和TNFα在炎症牙髓组织中的表达比健康牙髓组织中明显;HA、HAS2、HAS3分别和TNFα之间存在共表达;且炎症牙髓组织中HAS2的荧光染色信号比HAS3更强;而HAS1的荧光信号在健康及炎症牙髓组织中均较弱。qRT-PCR结果提示炎症牙髓组织中IL-6、IL-8、TNFα(PIL-6,IL-8,TNFα<0.01)表达较正常牙髓组织强,同时HAS2、HAS3(PHAS2,HAS3<0.01)的表达亦随之显著升高。结论HA以及HAS2、HAS3在炎症牙髓组织中的表达明显上调,这提示透明质酸可能参与了对牙髓组织炎症状态的调控。

透明质酸合成酶3在胎鼠下颌第一磨牙牙胚发育过程中的时空表达

目的:检测透明质酸合成酶3(HAS3)在胎鼠下颌第一磨牙牙胚不同发育时期的表达,探讨其在小鼠牙胚发育过程中的作用。方法:取不同胎龄的ICR胎鼠,制备其下颌第一磨牙不同发育时期的切片,采用免疫组化法检测HAS3在下颌第一磨牙牙胚组织中的表达情况。结果:在E11.5 d牙胚开始发育时,HAS3即在增厚的上皮板中表达;在E13.5 d蕾状期时,牙蕾中央的上皮细胞及其深层的牙源性间充质中,均可检测到HAS3的表达。E14.5 d帽状期至E18.5 d钟状晚期时,HAS3在牙胚星网状层以及牙源性间充质细胞均有较强表达,而在内外釉上皮细胞所在区域不表达或表达不明显。结论:透明质酸合成酶3在星网状层细胞以及牙乳头间充质中的持续高表达提示其可能与牙胚的形态发生密切相关。

内淋巴囊和肾小管上皮细胞透明质酸合成酶mRNA的表达

目的 用寡聚核苷酸探针检测内淋巴囊和肾小管上皮细胞透明质酸合成酶ｍＲＮＡ表达的异同。方法 通过查阅核酸序列数据库，自行设计并合成了透明质酸合成酶寡聚核苷酸探针，应用原位杂交技术检测透明质酸合成酶ｍＲＮＡ在豚鼠内淋巴囊和肾小管上皮细胞的表达。结果 在内淋巴囊近侧端、中间部和肾小管部分上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶ｍＲＮＡ的阳性表达，但近曲小管的阳性细胞百分数稍多。结论 不但扩大了核酸杂交的应用范围，还为内淋巴囊和肾小管上皮细胞对水电解质平衡可能都具有透明质酸／透明质酸酶的双重调节作用提供了理论依据。