透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K_vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS_PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达 ,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二者所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明 。

透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达

分别用质粒pJJ6 99与pUC1 9(vhb) ,pIJ70 2与pBR3 2 2 (vhb) ,构建大肠杆菌 链霉菌穿梭质粒 ,将透明颤菌血红蛋白基因转入金色链霉菌。在低溶解氧浓度下 ,透明颤菌血红蛋白的表达 ,可提高金色链霉菌氧的利用效率 ,产物合成比原始菌株提高 40 %～ 6 0 %。在局部低氧的环境中 ,采用四环素抗性基因启动子带动血红蛋白基因表达 ,可有效发挥透明颤菌血红蛋白的氧传递效率 。

利用透明颤菌血红蛋白基因在谷氨酸棒杆菌中的表达提高谷氨酸和谷氨酰胺的产量

为了降低谷氨酰胺 (glutamine,Gln)生产过程中所需要的高溶氧水平对设备的要求 ,在谷氨酸棒杆菌 C.glutamicum ATCC14 0 6 7中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因 (Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb) ,以此提高细胞的摄氧能力及能量的供给水平 .对得到的重组菌和野生菌进行了发酵实验 .在溶氧只有 5 %的条件下 ,重组菌比野生菌细胞干重提高了 1.2倍 ,单位细胞谷氨酸的生产能力提高了 6 .5倍 ,单位细胞谷氨酰胺的生产能力提高了 1.4倍 .对比结果显示 ,含有 vgb基因的重组菌比野生菌在细胞生长。

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌 (S .cinnamonensis)是莫能菌素 (Monensin)的产生菌。大肠杆菌 链霉菌穿梭表达载体pHZ12 5 2中的透明颤菌血红蛋白基因 (vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子PtipA之下 ,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定 ,发生了重组缺失 ,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌 (S .avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的 pHZ12 5 2 ,可在肉桂地链霉菌中稳定复制 ,不再发生缺失 ,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明 ,VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。

透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响

目的利用已含有血红蛋白基因(vgb)的红色糖多孢基因工程重组菌,探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的影响。方法用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定血红蛋白,用葡萄糖浓度与总蛋白质含量比较原始菌株与重组菌株的差别。结果红色糖多孢基因工程重组菌与原始菌株比较,重组菌株发酵过程葡萄糖浓度的变化出现在第二时段(约38h),原始菌株达到了0.4g/L,而重组菌株只有0.25g/L;第三时段原始菌株出现了游离葡萄糖浓度高峰而重组菌株未出现。在两个菌株中生物物质浓度[以总蛋白质(g/L)表示]存在不同,重组菌株比原始菌株约低27%。红霉素效价,原始菌株和重组菌株分别为3.98和5.15g/L,相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%。结论重组红色糖多孢菌表达了透明颤菌血红蛋白,提高了红霉素产率,对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。

透明颤菌血红蛋白基因表达对金色链霉菌生长代谢的影响

利用四环素抗性基因启动子在金色链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因。在 1m3 发酵罐中研究了工程菌株的生长代谢特性。在溶解氧充足的条件下 ,透明颤菌血红蛋白表达 ,对金色链霉菌生长代谢未产生明显影响 ,工程菌株与参比菌株的生长代谢特性基本一致 ,工程菌株和参比菌株金霉素最终浓度分别为 2 2 90 5u mL、2 2 896u mL。在低溶解氧条件下 ,透明颤菌血红蛋白的表达 ,可促进金色链霉菌菌体生长、菌丝活力保持和金霉素的合成 :工程菌菌体浓度比参比菌株高 5 %～ 1 0 % ,产物合成提高 1 1 4%。

透明颤菌血红蛋白基因在链霉菌中的克隆和表达

以质粒ｐＩＪ７０２和ｐＩＪ６９９为载体，构建了两个带有透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌａ）血红蛋白（ＶＨｂ）基因（Ｖｇｂ）的大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒并转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１、变青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ６４及蒽环类抗生素阿柔比星（阿克拉菌素）产生菌——加利利链霉菌（Ｓ．ｇａｌｉｌａｅｕｓ）ＡＴＣＣ３１１３３，经ＣＯ结合差光谱法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析表明Ｖｇｂ在大肠杆菌和链霉菌中得到表达。通过改变培养条件研究溶氧对Ｖｇｂ表达的影响，结果表明在低溶氧的情况下，ＶＨｂ表达量增加。同时发现，在低氧浓度时，ＶＨｂ的表达有利于链霉菌菌体的生长，其菌体生长量高于同样条件下的对照菌株（Ｖｇｂ－）１７％～２９％。

透明颤菌血红蛋白及其基因的研究进展

Vitreoscillais a Gram negative obligate aerobic bacterium , whose mostimportant prop ertyisthe ability to producethe Vitreoscilla hemoglobin (VHb) .VHbisencoded by asingle gene called Vitreoscilla hemoglobin gene (vgb) containing the naturalpromoter,and the expression of vgb geneis regulated by dissolved oxygen atthe level oftranscription . The oxygen binding VHb participateinthe metobolism processofcellsand makethem grow wellinthe hypoxic habitats.Ital so facilitates the bacteria growing and the potein producing obviously. The potential application prospectforthe oxygenregulated promoterof vgb andthe physiologicalfunction of VHbinthefer mentationindustryisreviewed.

透明颤菌血红蛋白基因调控与功能的研究

透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌａ）血红蛋白（ＶＨｂ）是一种氧调节、氧结合蛋白。其基因（ｖｇｂ）已被克隆及表达。ｖｇｂ基因表达在转录水平上受氧控制，ＦＮＲ蛋白作为厌氧激活子介入该调节过程。ＶＨｂ可与氧结合参与细胞代谢过程，使细胞适应贫氧环境。

透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达

将含有自身启动子的透明颤菌血红蛋白基因（ ｖｈｂ） 克隆至大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体ｐＩＪ６５３ 中构建成表达载体ｐ ＷＹ１０１ 和ｐ ＷＹ１０２ ，用它们转化阿维菌素（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ） 产生菌———阿维链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ） ，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析并未检测到ｖｈｂ 基因表达，但用穿梭载体ｐＨＺ１２５２（ 其中的ｖｈｂ 基因位于受硫链丝菌素诱导的链霉菌强启动子ＰｔｉｐＡ之下） 转化阿维链霉菌并经硫链丝菌素诱导，则在该菌中表达出了有活性的ＶＨｂ 蛋白。ｐＨＺ１２５２ 在阿维链霉菌中发生了重组缺失，但缺失的ｐＨＺ１２５２ 上仍含有完整的ｖｈｂ 基因及诱导型强启动子，且可在阿维链霉菌中稳定遗传，却不能再转化大肠杆菌。

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达,分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO(TvDAAO)的N-端融合蛋白。其中,MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时,目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右,比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍;但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时,DAAO酶活达到了3.24u/mL,比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。

透明颤菌血红蛋白的表达及对基因工程菌的影响

利用已克隆的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),构建了一批复制类型和抗生标记不同的vgb表达载体,并就vgb基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明vgb基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至20％饱和度时迅速合成。vgb基因的表达产物(Vitreoscilla Hemoglogin,VHb)可促进青霉素酰化酶和TNF、IL-2等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于vgb基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发酵过程中溶氧控制裕度。这些实验结果预示着vgb基因在耗氧生物过程中,如抗生素工业和基因工程菌高密度发酵,有着良好的应用前景。

透明颤菌血红蛋白的研究进展及其在发酵工业中的应用

透明颤菌血红蛋白(vitreoscilla hemoglobin,VHb)是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白,该蛋白质能使透明颤菌在低氧的环境下生存,并保持较高的生长速率。随着其作用机理的深入研究,VHb在生物工程领域的应用越来越广泛。总结了近年来VHb的研究进展,包括蛋白结构、细胞定位、基因改组、作用机理等方面的研究,并概述了其在微生物发酵工业中的应用。

透明颤菌血红蛋白基因在产PHB重组大肠杆菌中的引入

将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)采用插入染色体的方式引入产聚 β 羟基丁酸酯(PHB)重组大肠杆菌VG1 (pTU1 4)中 ,以从分子水平上提高克隆菌对氧的利用率 ,解决PHB发酵生产过程中的供氧矛盾 ,透明颤菌血红蛋白的一氧化碳差光谱分析明表 ,vgb基因可以在VG1 (pTU1 4)中成功表达 ,且其表达量受溶氧水平的调控。vgb基因的引入可以同时促进菌体生长和PHB产品的积累 ,且溶氧水平越低 ,VHB表达量越高 。

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转移到链霉菌染色体整合载体的构建

链霉菌抗生素的生物合成对培养环境中氧的供应相当敏感 ,为了改善这一溶氧问题 ,本研究通过将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)克隆到含ФC31int,attP基因的诱导型表达载体pIJ86 0 0上 ,构建了可接合转移到链霉菌的整合型表达vgb基因的质粒 pHZ12 76。pHZ12 76通过接合转移导入变铅青链霉菌 (Streptomyceslivi dans) ,所得重组子经Southern杂交验证后 ,进行诱导表达 ,菌体经破碎后所得蛋白粗提物经Western杂交和CO结合试验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。

利用PCR法扩增透明颤菌血红蛋白基因条件的优化

以透明颤菌染色体基因组DNA为模板,利用PCR技术获取透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)。在多聚合酶链式反应中采用碱变性模板与热启动等方法进行透明颤菌血红蛋白基因体外扩增,成功地扩增出约0.5 kb的透明颤菌血红蛋白基因,并对vgb的PCR条件进行了研究。获取理想的目的基因PCR反应的综合参数比十分重要。

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。

透明颤菌血红蛋白基因在提高枯草芽孢杆菌产脂肽功能中的研究

脂肽是一类具有特殊作用的生物表面活性剂。本实验将血红蛋白基因(vhb)置于RDR细菌启动子驱动下的质粒PSET中,构建PSET-RDR-vhb重组质粒,并通过电激作用转入脂肽代谢菌株-枯草芽孢杆菌株(bacillus subtilis)ZW-3中,转化菌株经酶切和PCR电泳检测鉴定,Southern-blot杂交显示部分转化菌株中外源基因插入基因组DNA,采用一氧化碳差异色谱法测定了血红蛋白的表达量。实验进一步对转化菌株的生长曲线、总蛋白量、过氧化氢酶活性、脂肽的产率进行了测定,结果显示,相比于原始菌株,转化菌株数据均有明显提高。

透明颤菌(沈阳株)血红蛋白基因克隆与序列分析

目的:以透明颤菌(Vitreoscilla)基因组DNA为模板,扩增透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。方法:采用PCR与基因重组技术,将PCR产物插入到克隆载体PET28a中,测序应用DNA测序仪。结果:获得了约0.5kb DNA片段,测序结果与已发表的透明颤菌血红蛋白基因核苷酸序列比较,同源性为97%。结论:所扩增的DNA片段确认是透明颤菌血红蛋白基因。

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在阿维链霉菌的整合表达

pHZ1276是透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的诱导型表达载体,携带有硫链丝菌素诱导的强启动子PtipA和ФC31int,attP基因使载体整合在染色体上。本研究利用组成型启动子ermP1P2替代pHZ1276上的诱导型启动子PtipA构建了组成型表达血红蛋白基因的质粒pHZ1291。将vgb基因去掉后构建了组成型链霉菌表达载体pHZ1294。将pHZ1276,pHZ1291导入阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)NRRL8165,所得重组子经Southern杂交验证后,蛋白粗提物经Western杂交和CO结合实验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。