通用真菌引物和探针检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法

目的建立实时定量PCR（RQ-PCR）以真菌通用引物和探针快速准确检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法，并与细菌相鉴别及进行初步临床应用。方法选择临床常见的真菌基因组多拷贝基因5.8S rDNA作为靶基因设计特异性通用真菌引物和TaqMan探针，采用QIAamp血液DNA小提试剂盒提取多种致病真菌基因组DNA，建立20 μl RQ-PCR反应体系，对含有不同载量致病真菌的模拟人全血标本和71份外科发热患者全血标本进行侵袭性真菌基因组的定量检测。结果本方法的特异性良好，检测限为101拷贝/μl上机待测液 （即约105 拷贝/ml 全血）；检测灵敏度和特异度分别为95.5%和97.6%，阳性预告值和阴性预告值分别为98.7%和92.0%；标准曲线R2在0.9931~0.9977；批内及批间平均变异系数分别为（10.4±4.0）%和（27.9±2.0）%；人血标本中真菌基因组DNA平均回收率为（91.0±7.6）%，相对回收率平均变异系数为（14.9±4.0）%。71份外科发热患者血标本中未检测出侵袭性真菌基因组。结论RQ-PCR可以借通用真菌引物和TaqMan探针快速、特异、灵敏地定量检测人血标本中侵袭性真菌DNA的载量并可与细菌相鉴别，且有着较好的准确度与精密度。外科发热患者血中侵袭性真菌基因组的存在率可能很低。