沙门氏菌通用PCR快速检测试剂盒的研制与应用

根据沙门氏菌fimY基因建立了用于检测沙门氏菌的通用PCR方法。对收集的A-F群标准菌株和临床分离的60株沙门氏菌分离株和11种非沙门氏菌进行PCR检测,采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果所有沙门氏菌均扩增出526bp的特异性条带,而非沙门氏菌均未扩增出任何条带。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中93cfu的沙门氏菌,还可检出含3cfu的样品用BP预增菌或MM增菌后的菌液。说明该方法敏感性高、特异性强。采用直接菌体加入法、热裂解、反复冻融、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CTAB法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒同样的效果,且操作简便快速、经济、效果好,值得推广应用。

通用PCR法在痰标本真菌检测中的临床应用价值分析

目的:探讨通用PCR法在痰标本真菌检测中的临床应用价值。方法:选择2015年9月至2017年9月本院收治的免疫力低下患者178例作为研究资料,各收集痰标本2份,其中一份用于PCR扩增,另一份经培养后若观察到真菌或可疑菌落,则提取后在此进行PCR扩增测序。比较3种方法对真菌的检出情况、真菌阳性率,与组织病理学结果进行比较,分析3种方法的诊断效能。结果:178份痰标本经平板培养可观察到107份真菌生长,其余71份未见真菌生长。挑取真菌及可疑菌落行PCR结果显示阳性、阴性分别115、63份。对痰标本直接PCR结果显示,阳性、阴性分别124、54份。PCR扩增产物测序结果显示大多是白色念珠菌感染,仅3份是曲霉菌感染。内对照扩增验证结果显示有1份阴性标本存在扩增抑制现象。3种方法的真菌阳性率:直接PCR法>痰培养后PCR法>痰培养,但组间无显著差异(P>0.05)。3种方法诊断效能总体趋势:直接PCR法>痰培养后PCR法>痰培养,其中直接PCR法与痰培养后PCR法的特异度、准确度均显著高于痰培养法(P<0.05),直接PCR法的敏感度显著高于痰培养法(P<0.05)。结论:通用PCR法在痰标本真菌检测中的临床应用价值较高,直接PCR具有操作简单、快速等优势。

结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法

通用引物与载体多克隆位点两端序列互补,将目的片段构建入载体pGEM-T Easy中,利用载体通用引物M13F和M13R结合片段特异引物进行菌液PCR反应。用PCR产物电泳结果来筛选阳性克隆并鉴定目的片段插入方向,同时能有效对短插入片段重组子进行筛选与鉴定。最终以DNA测序结果来验证,与测序结果一致,显示通用引物PCR方法对阳性克隆的筛选和鉴定优于传统酶切和普通PCR鉴定方法,能够弥补传统方法的不足,且简便快速,可作为筛选和鉴定阳性克隆的有效手段。

TaqMan MGB双探针法和通用模板PCR法检测慢性乙型肝炎病毒YMDD变异的比较

目的对检测HBV YMDD变异的TaqManMGB双探针法和通用模板PCR法做方法学比较,探讨其临床实用性。方法分别以TaqManMGB双探针和通用模板PCR法,对拉米夫定治疗过程中血清出现HBV DNA由阴转阳的87例慢性乙型肝炎患者,进行HBV YMDD变异检测,并以测序结果为标准,比较它们的灵敏度和特异性。结果TaqMan探针法和通用模板PCR法检测灵敏度分别为100%和93.02%,特异性均为100%,与测序法的符合率为98.9%和96.6%。两种方法学敏感度分别为5.0×105copies.L-1和1.0×106copies.L-1。结论TaqMan探针法检测HBV YMDD变异灵敏度高、特异性好,是临床检测HBVYMDD的较好方法。

应用通用引物PCR技术检测食品标本中产肠毒素性葡萄球菌

本实验采用笔者建立的通用引物ＰＣＲ扩增法检验了肉、奶等食品样品２１４份，检出３份阳性，其中１份产生ＳＥＢ，另２份产生ＳＥ或ＳＥＤ；在三株产肠毒素葡萄球菌中，有一株为血浆凝固酶阴性菌株。食品标本敏感性试验表明，该法可检出肉、奶食品中１０＾１个细菌。整个检测结果可在１￣１．５天内完成。

玉米顶腐镰孢菌rDNA-ITS和EF-1a基因序列及UP-PCR遗传多样性分析

对采自辽宁省部分地区的45份玉米顶腐病病株进行分离培养,共获得89株镰孢菌,采用传统形态学分类和现代分子生物学方法,共鉴定出4个种,分别为:亚粘团镰孢菌(Fusarium subglutinans)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)、层生镰孢菌(F.proliferatum)和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)。经EF-1a基因序列建立系统发育树,将顶腐镰孢菌分为4个组。用5条通用引物经UP-PCR扩增后,扩增出57条谱带,其中多态性条带53条,占总条带数的93.0%。遗传多样性分析表明,当相似系数0.626时,可将24个菌株划分为4个组,EF-1a基因序列与UP-PCR和ITS序列相比,更能体现镰孢菌种间和种内的亲缘关系及遗传差异性。

PCR方法检测实验动物皮肤病原真菌

目的对用于实验动物皮肤病原真菌检测的分子生物学方法即皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR(任意引物聚合酶链式反应)相结合技术的特异性及敏感性进行评价,并通过建立动物模型及实际的皮肤真菌检测来验证此方法的可行性。方法特异性测定:用皮肤病原真菌通用引物进行PCR,扩增大肠杆菌DNA、犬肝炎病毒DNA及小鼠肝癌H22细胞DNA。敏感性测定:以紫外分光光度法测定DNA质量浓度,根据测定值将DNA进行10倍系列质量浓度稀释,得到100 ng^10 fg的8个质量浓度,然后对其进行PCR扩增。建立实验动物皮肤病原真菌感染的动物模型。用皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR相结合技术检测从动物模型及河北省各地的实验动物单位采集的动物皮肤标本。结果用皮肤病原真菌通用引物扩增实验动物三种皮肤病原真菌标准菌株,均扩增出大小为440 bp的条带,而大肠杆菌、犬肝炎病毒、小鼠肝癌H22细胞均未扩增出条带。皮肤病原真菌通用引物PCR敏感性测定,模板DNA 100 ng^100 fg的7个系列浓度均扩增出了阳性条带,10 fg为阴性。建立了实验动物皮肤病原真菌感染的动物模型。对河北省各地的实验动物皮肤真菌检测过程中出现一例通用引物阳性标本。结论皮肤病原真菌通用引物(CHS1 1S,CHS1 1R)具有较强的特异性,敏感度为100 fg;将皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR技术相结合可用于检测实验动物皮肤病原真菌。

PCR-DGGE结合测序在检测混合细菌感染中的价值

目的探讨变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)结合测序在检测混合细菌感染中的作用,为细菌多重感染的诊断提供新的思路。方法以3份临床培养鉴定为混合感染的胆囊穿刺引流液为对象,提取细菌总DNA并扩增16S rDNA-V3区,后进行DGGE分析,将所得条带切胶纯化再扩增,扩增产物进行测序及BLAST比对,比较比对结果与临床培养结果的一致性。结果 DGGE可以很好地分离16S rDNA-V3区混合PCR产物,每一个扩增子的测序比对结果与临床培养结果一致。结论 PCR-DGGE结合测序的方法可以很好地鉴定临床混合感染标本中的病原菌,可作为快速检测方法在临床应用。

Use of species-specific PCR for the identification of 10 sea cucumber species

We developed a species-specific PCR method to identify species among dehydrated products of 10 sea cucumber species.Ten reverse species-specific primers designed from the 16 S rRNA gene,in combination with one forward universal primer,generated PCR fragments of ca.270 bp length for each species.The specificity of the PCR assay was tested with DNA of samples of 21 sea cucumber species.Amplification was observed in specific species only.The species-specific PCR method we developed was successfully applied to authenticate species of commercial products of dehydrated sea cucumber,and was proven to be a useful,rapid,and low-cost technique to identify the origin of the sea cucumber product.

猪冠状病毒通用荧光定量PCR检测方法的建立

已知感染猪群的冠状病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV);本研究拟建立针对这6种病毒的通用荧光定量PCR检测方法。依据NCBI公布的这6种猪冠状病毒序列,利用MEGA软件进行全基因序列比对,通过分析在ORF1b中找到1段长为196 bp的保守序列,设计兼并引物,建立了用于检测猪冠状病毒的通用荧光定量PCR检测方法;结果显示,该检测方法能扩增出6种猪冠状病毒,对PDCoV、PRCV、PHEV、SADS-CoV、TGEV的灵敏性均可达到101拷贝/μL,对PEDV的灵敏性可达到100拷贝/μL;与CSFV、PRRSV、PPV、PCV、PRV无交叉反应,特异性良好;组内和组间变异系数均小于2.2%,重复性良好。利用建立的检测方法对62份病料进行检测,检测出27份样品呈现猪冠状病毒阳性,而利用普通RT-PCR方法共检测出24份阳性样品。选择2份猪冠状病毒阳性样品进行克隆测序,在NCBI上进行比对,通过同源性分析,分别鉴定为PDCoV和PEDV感染。本试验建立的猪冠状病毒通用荧光定量PCR检测方法特异性、重复性好,敏感性高,能用于对猪冠状病毒的检测和流行病学调查,同时还可监测猪新型冠状病毒的出现。

蔬菜保护地木霉菌rDNA-ITS序列和UP-PCR遗传多样性分析

采用传统形态学分类和ITS序列比对的方法,研究蔬菜保护地土壤中木霉菌种群分布和遗传多样性。木霉菌分离培养结果显示,共获得397株木霉菌,鉴定出11个种,分别为:长枝木霉Trichoderma longibrachiatum、深绿木霉T.atroviride、哈茨木霉T.harzianum、粘绿木霉T.viren、微孢木霉T.minutisporum、拟康木霉T.pseudokoningii、黄绿木霉T.aureoviride、非钩木霉T.inhamatum、棘孢木霉T.asperellum、长孢木霉T.longipile和螺旋木霉T.helicum。经ITS序列建立系统发育树后,将木霉菌分为5个组。用5条通用引物经UP-PCR扩增后,扩增出46条谱带,其中多态性条带43条,占总条带数的93.5%。遗传多样性分析表明,当相似系数为0.80时,可将24个菌株划分为9个组。UP-PCR与ITS序列相比,更能体现木霉菌种间和种内的亲缘关系及遗传差异性,可以作为木霉菌分类的辅助方法。

人乳头瘤病毒感染与结直肠癌的相关性

目的检测195例结直肠癌样本中人乳头瘤病毒(HPV)的感染情况。方法利用通用PCR法检测结直肠癌样本中的HPV DNA,随后用荧光定量PCR和直接测序法对HPV DNA阳性样本进行HPV分型,同时统计HPV阳性标本的Kras、PIK3CA和BRAF基因突变情况和临床病理特征。结果结直肠癌标本中HPV感染阳性率为17.94%(35/195),以HPV16、18型感染为主,且存在混合感染;HPV感染阳性标本中Kras基因突变率为42.85%,PIK3CA、BRAF基因突变率均为2.86%,HPV感染与三个基因突变的相关性均无统计学意义;阳性标本中以右半结肠的癌变居多,癌组织以中分化为主,临床Ⅱ期多见,多无淋巴结的转移。结论 HPV感染可能与结直肠癌的发生有关,但与Kras、PIK3CA、BRAF基因突变无关。

利用寡核苷酸芯片鉴定多种肠道致病菌方法的建立与初步应用

目前，临床上对腹泻样本的检测主要依靠传统的细菌学培养及生化鉴定，操作方法繁琐，检测周期较长，而利用分子生物学方法如PCR、探针杂交等及免疫学方法也存在特异性差和灵敏度低等问题。自寡核苷酸芯片技术建立以来，以其特异性高、操作简单、高通量、快速等特点，已广泛应用于生物学的各个研究领域。目前，寡核苷酸芯片应用于病原菌检测的研究较多，但同时检测的病原菌数量较少。本实验采用通用引物PCR结合寡核苷酸芯片对10种临床检测的肠道致病菌进行鉴定。