荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较

为建立一种快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的方法,试验采用RT-LAMP和荧光定量RT-PCR两种检测方法,与通用RT-PCR方法在特异性、灵敏性、样品检出率、试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单程度和检测成本高低七个方面对BVDV进行了综合性比较分析。结果表明:试验建立的RT-LAMP方法与荧光定量RT-PCR、通用RTPCR方法相比具有特异性强、灵敏度高、样品检出率和扩增反应效率高、操作简便快速、低成本等特点。说明RT-LAMP方法对快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病、防止疫情的扩散具有重要意义。

非洲马瘟病毒VP7和NS2双重荧光RT-PCR检测技术的建立与应用

利用DNAMAN软件对非洲马瘟病毒不同基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的VP7和NS2基因设计合成引物和探针。人工分别合成包含有扩增区域的VP7和NS2核苷酸片段进行双向(T7和SP6)体外转录制备双链RNA(dsRNA)。使用制备的dsRNA在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上,建立了适用于非洲马瘟病毒检测的双重通用荧光定量RT-PCR检测技术。应用建立的方法对非洲马瘟病毒核酸,马流感病毒核酸,马流产沙门氏菌核酸,马链球菌兽疫亚种核酸,东、西部马脑脊髓炎病毒核酸进行检测,结果显示该检测技术可以有效检测非洲马瘟病毒核酸,而对其它病原核酸检测结果为阴性,证实本技术的特异性强、可靠性好。对已知拷贝数的dsRNA检测结果表明,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达1.0×102拷贝/反应,相比于基于凝胶电泳常规RT-PCR方法,其灵敏度高10倍;而且双基因的检测设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。在对248份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足非洲马瘟病毒快速诊断的需要。

牛呼吸道合胞体病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)通用型实时荧光RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的各型BRSV N基因序列共有保守区域设计引物,首先建立了检测BRSV的常规RT-PCR方法。结果显示,该常规RT-PCR检测方法特异性良好,仅检测靶标病毒呈阳性,检测限为1.71×10^(3) copies/μL。在此基础上,基于SYBR GreenⅠ染料建立了检测BRSV的实时荧光RT-PCR方法,该方法特异性良好,检测限为1.71×10^(1) copies/μL,其检测灵敏度显著高于常规RT-PCR方法。利用建立的常规RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法对采集的46份牛鼻拭子样本和22份牛肺脏样本进行平行检测。结果显示,常规RT-PCR方法从牛鼻拭子和肺脏样本中分别检出10份和4份呈阳性,实时荧光RT-PCR方法分别检出13份和6份呈阳性,实时荧光RT-PCR方法的阳性检测率高于常规RT-PCR方法。本研究建立的BRSV通用型实时荧光RT-PCR方法为BRSV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。