大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液对皮层神经元活性的影响以及通络救脑注射液的干预作用

目的:探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对神经元活性的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法:制备正常、正常用药、拟缺血损伤、拟缺血损伤用药4种脑微血管内皮细胞条件培养液(N-CM、NT-CM、I-CM、IT-CM),分别作用于培养的皮层正常神经元和拟缺血损伤神经元,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测分析各个条件培养液对神经元活性的影响特征。结果:①N-CM对正常神经元无明显影响,但对拟缺血损伤的神经元表现出一定的保护作用,尤其是NT-CM可明显提高受损的神经元活性;②I-CM可降低正常神经元活性,对已受损的神经元则进一步加重损伤,IT-CM可明显改善这种损伤状态。结论:脑微血管内皮细胞的旁分泌作用可能在中枢系统缺血性损伤中起重要作用,有可能是不能透过血脑屏障的中药成分发挥治疗作用的靶点。

不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用

目的探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对损伤神经元线粒体功能的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法制备(1)正常内皮细胞条件培养液(N-CM):正常培养的内皮细胞不作任何处理;(2)正常用药内皮细胞条件培养液(NT-CM):通络救脑注射液按1μl/ml浓度作用10h;(3)缺氧损伤内皮细胞条件培养液(I-CM);(4)缺氧损伤用药内皮细胞条件培养液(IT-CM):于损伤前4h,加入通络救脑注射液1μl/ml;分别作用于糖氧剥夺损伤的神经元模型,通过测定神经元线粒体活性、线粒体膜电位(MMP)及细胞色素C(CytC),分析各个条件培养液对损伤神经元线粒体功能的影响。结果(1)与模型组比较,N-CM组与NT-CM组(P<0.05)均可阻抑损伤神经元线粒体活性的下降,尤其是NT-CM保护作用更为明显。(2)与正常组比较,模型组MMP明显下降;I-CM使受损神经元的线粒体功能进一步下降;I-CM组可进一步降低受损神经元MMP,IT-CM可逆转神经元MMP下降,明显改善这种损伤状态。(3)N-CM组与NT-CM组均可降低损伤神经元的CytC释放,分别与模型组、I-CM组比较,差异均有显著性(P<0.05)。结论脑微血管内皮细胞的旁分泌功能对损伤神经元的存活有重要的调节作用,该作用的实现可能与维持神经元线粒体功能有关,通络救脑注射液可促进该作用的发挥。

通络救脑注射液对脑微血管内皮细胞活性影响的特征

目的:观察通络救脑注射液对培养的正常及缺血脑微血管内皮细胞的活性影响,揭示其通络作用的效应靶点与特征。方法:原代培养大鼠脑皮质微血管内皮细胞,传至第三代,分为正常及拟缺血组,采用培养基氧糖剥夺(OGD)法建立拟缺血模型。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法测定不同浓度的通络救脑注射液对正常及OGD内皮细胞的活性影响。结果:通络救脑注射液作用于正常脑微血管内皮细胞,与未加药组比较,小剂量药物抑制细胞活性趋势,大剂量促进细胞活性趋势,剂量总趋势呈反抛物线形;通络救脑注射液作用于OGD组脑微血管内皮细胞,小剂量范围促进内皮细胞的增殖活性,呈显著和极显著差异,而大剂量组则抑制细胞活性,剂量总趋势呈抛物线形。结论:通络救脑注射液对正常及缺血脑微血管内皮细胞具有双向调节作用,药物剂量与细胞增殖活性呈非线性关系。大剂量与小剂量可能是不同的作用机制,反映了中药复方药效的多维性。

通络救脑注射液对大鼠脑微血管内皮细胞活性及其条件培养液影响的初步研究

目的:观察通络救脑注射液对正常及拟缺血大鼠脑微血管内皮细胞的活性影响,并初步探讨细胞条件培养液内蛋白分泌的时效特征、奠定可溶性蛋白深入分析的技术基础。方法:通络救脑注射液作用于正常及拟缺血脑微血管内皮细胞之后,用MTS/PMS比色分析法测定细胞的活性,Bradford法测定细胞培养液总蛋白含量,比色分析法测定细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)漏出值,同步观察了5个时间点的细胞活性及条件培养液总蛋白量及LDH释放量。结果:通络救脑注射液能够提高拟缺血细胞的活性,且抑制LDH释放量;正常组分泌总蛋白量3h达到高峰,此时细胞活性最佳,LDH释放量亦少。拟缺血组分泌总蛋白量是6h达到高峰,此时LDH释放量最少,但细胞活性与3h比较有所下降。结论:通络救脑注射液对拟缺血细胞损伤具有保护作用;以3h至6h的细胞条件培养液做为收集目标是研究条件培养液的最佳时间段。

通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达的影响

目的 :观察通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达的影响。方法 :采用三氯化铁致大脑中动脉血栓形成大鼠脑缺血模型 ,免疫组织化学方法及图像分析 ,统计使用t检验。结果 :模型组大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达与假手术对照组比较明显增强 ,通络救脑注射液各组大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达与模型组比较明显降低。结论

通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用

目的通过观察通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性的影响,以及对血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)及其受体内皮特异性酪氨酸激酶受体-2(endothelial-specific tyrosine kinasereceptor 2,Tie-2)表达的影响,以评价其对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用。方法利用氧糖剥夺方法复制人脑微血管内皮细胞拟缺血损伤模型,通络救脑注射液及其有效成分分别作用不同时间后,采用四甲基偶氮唑盐染色法测定细胞活性,采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率检测细胞损伤程度,采用蛋白印迹法检测内皮细胞Ang-1和Tie-2表达水平。结果通络救脑注射液可显著提高拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性,降低LDH漏出率,增加内皮细胞Ang-1和Tie-2的表达,两个有效成分发挥疗效的时间有所不同,复方注射液作用明显优于两个有效成分。结论通络救脑注射液对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞具有保护作用,其机制与增加Ang-1及其受体Tie-2表达有关,显示中药组方可发挥整合调节的治疗优势。

通络救脑注射液及其组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3表达及其功能的影响

目的:观察通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞谷氨酸受体3(glutamate receptor 3,GluR3)表达及其功能的影响。方法:采用大鼠原代培养脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血模型,分别用通络救脑注射液及其2组分栀子苷、三七总皂苷对细胞进行干预,采用PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中GluR3 mRNA及蛋白表达水平,并用免疫蛋白印迹法检测GluR3调节的下游分子基质金属蛋白酶诱导因子CD147、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表达情况。结果:通络救脑注射液及其组分能够从基因到蛋白水平显著下调GluR3的表达,对CD147、MMP-9也有显著下调作用,且通络救脑注射液疗效优于2组分。结论:通络救脑注射液及其组分可调节拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3的表达及其功能,这可能是其在脑缺血性损伤中保护血脑屏障、减轻炎症反应的机制之一。通络救脑注射液效果优于2组分,显示了复方配伍发挥整合调节的疗效优势。

Semaphorin 3A在局灶性脑缺血大鼠脑组织中的表达特征及通络救脑注射液的保护作用

目的:观察局灶性脑缺血损伤后大鼠脑组织中Semaphorin 3A(Sema3A)蛋白表达水平,以及通络救脑注射液对该因子表达的影响。方法:以线拴法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO),设正常组、模型组及通络救脑注射液组,分别在造模后12h、24h、3d、7d,共4个时间点采取动物脑组织,测定脑梗死体积及脑组织中GAP43的表达水平,及Sema 3A的表达部位和蛋白表达水平。结果:通络救脑注射液能够减少脑缺血动物脑梗死体积,与模型组相比均有显著差异。结论:大鼠脑缺血损伤后Sema3A表达增加与神经元的坏死有相关性,通络救脑注射液能够降低其表达水平,对缺血损伤的脑组织发挥保护作用。

通络救脑注射液对Aβ1-42诱导原代大鼠脑微血管内皮细胞氧化应激反应及细胞凋亡的影响

目的:探讨通络救脑注射液对Aβ诱导下原代大鼠脑微血管内皮细胞氧化应激反应及细胞凋亡因子Caspase-3蛋白表达的影响。方法:模型组以Aβ1-42加入内皮细胞培养基中制备阿尔茨海默病(AD)内皮细胞损伤模型,通络救脑注射液(简称TLJN)组在造模前先行加入通络救脑注射液干预。采用生化法检测各组内皮细胞中MDA含量、SOD活性,运用Western Blot法检测各组Caspase-3蛋白表达。结果:TLJN组能明显降低AD内皮细胞损伤模型中MDA含量、提高SOD活性;抑制Caspase-3蛋白表达。结论:在本实验观察范围内,通络救脑注射液对Aβ诱导下原代大鼠脑微血管内皮细胞的凋亡有抑制作用,其作用机制可能是通过提高SOD抗氧化酶活性、降低MDA含量,进而下调Caspase-3蛋白表达以抑制细胞凋亡。

通络救脑注射液对氧糖剥夺大鼠脑微血管内皮细胞胎盘生长因子表达的影响

[目的]探讨通络救脑注射液对氧糖剥夺大鼠脑微血管内皮细胞胎盘生长因子(PLGF)及其受体血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)表达的影响。[方法]通过氧糖剥夺(OGD)方法复制脑微血管内皮细胞拟缺血损伤模型。实验分为正常对照组、氧糖剥夺模型组、通络救脑注射液干预组,分别采用酶联免疫吸附法和免疫印迹法检测脑微血管内皮细胞条件培养液中PLFG的含量,以及内皮细胞VEGFR-1的表达。[结果]通络救脑注射液可以显著提高氧糖剥夺模型大鼠脑微血管内皮细胞PLGF及其受体的表达,与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。[结论]通络救脑注射液能够增加拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞PLGF及其受体的表达,提示提高PLGF及其受体的表达是该中药复方发挥清热、解毒、通络药效的分子途径之一。

通络救脑注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤脑保护的IGF-1途径分析

目的:观察通络救脑注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及探讨其发挥保护作用的可能途径。方法:以线栓法构建大鼠大脑中动脉局灶缺血再灌注损伤模型,实验动物随机分为假手术组、模型组、通络救脑药物组、阳性药对照(依达拉奉)组。各设3个时间点,分别为脑缺血再灌注后24h、3d和7d,以TTC染色法测定脑组织梗死体积;以酶联免疫(ELISA)、免疫组化法分别检测血清、脑组织匀浆IGF-1表达水平及表达部位。结果:通络救脑注射液能显著减小各时间点的大鼠脑梗死体积比;缺血再灌注3d通络救脑组大鼠血清IGF-1水平显著升高,模型组和通络救脑组大鼠脑匀浆IGF-1水平与假手术组比较显著提高;免疫组化亦提示缺血侧皮层IGF-1的阳性表达面积比在通络救脑组均显著高于相应时间点的模型组。结论:通络救脑注射液能显著减小局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积,且与提高IGF-1的表达有关。

通络救脑注射液对Aβ_(25-35)所致AD大鼠记忆功能的保护作用

目的观察通络救脑注射液对Aβ_(25-35)所致AD大鼠记忆功能的保护作用及作用机制。方法取健康SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、通络救脑注射液组(80、40、20mg/kg),每组12只。大鼠海马CA1区注射Aβ_(25-35)制备老年痴呆模型,造模后连续给药28d,Morris水迷宫法进行定位航行试验,同时测定大鼠大脑皮层组织匀浆ChAT、AChE的活性变化。结果通络救脑注射液组可以缩短AD大鼠寻找站台时间,同时能升高ChAT活性,降低AChE活性。结论通络救脑注射液可以改善Aβ_(25-35)所致AD大鼠学习记忆障碍,其作用可能与调节中枢神经递质ChAT、AChE活性有关。

通络救脑注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

目的观察通络救脑注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠记忆功能的保护作用及作用机制。方法采用改进的Longa法制备大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型,观察通络救脑注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分的影响,以及大鼠血清中CK、LDH、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性的变化。结果与模型组相比,通络救脑注射液能改善大鼠神经行为,降低CK、LDH、MDA含量,明显升高SOD活性。结论通络救脑注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。

通络救脑注射液对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及氧化应激反应的影响

目的:探讨通络救脑注射液(Tong Luo Jiu Nao injection,TLJN)对阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)模型大鼠的防治作用及其抗氧化机制。方法:采用脑内定位注射β淀粉样蛋白(βamyloid1-42)建立AD大鼠模型,在模型建立成功的同时给予TLJN治疗。采用Morris水迷宫进行AD大鼠的行为学检测,用化学比色法检测大脑皮质丙二醛(MDA)的含量。结果:与正常组比较,AD模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.01),目标象限停留时间明显缩短(P<0.01);TLJN治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),目标象限停留时间明显增加(P<0.05)。AD模型组大鼠脑皮质中MDA含量增加(P<0.01);TLJN治疗组,脑皮质MDA含量显著减少(P<0.01)。结论:TLJN具有改善学习记忆能力,对抗大鼠神经系统的退行性病变有一定的作用,可能通过抑制AD模型大鼠脑皮质MDA产生发挥其保护作用。

通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞BDNF表达的影响

目的:研究通络救脑注射液及其2组分三七总皂苷、栀子苷对拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的影响。方法:采用原代培养大鼠脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血损伤模型,三七总皂苷、栀子苷以及通络救脑注射液干预后,采用免疫蛋白印迹法和细胞免疫荧光法检测BDNF的表达情况。结果:与模型组比较,栀子苷对BDNF的上调作用不明显,三七总皂苷和通络救脑注射液可显著上调BDNF的表达,通络救脑注射液有优于2组分的作用趋势。结论:通络救脑注射液及其有效组分具有一定的促进BDNF表达的作用,这可能是该注射液在缺血性脑损伤后保护微血管和促进血管新生的内在机制之一。注射液的作用优于2组分,体现了中药复方的配伍优势。

通络救脑注射液对Aβ_(1-40)致脑微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨通络救脑注射液及其有效成分对脑微血管内皮细胞的保护作用及机制。方法建立β淀粉样蛋白(Aβ_(1-40))致人脑微血管内皮细胞(h BMECs)损伤模型,用通络救脑注射液及其有效单体成分京尼平苷、人参皂苷Rg1干预,采用CCK-8染色法测定细胞活性,检测条件培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,Western blot法检测h BMECs高度糖基化终产物受体(RAGE)的表达。结果通络救脑注射液及其有效单体成分京尼平苷、人参皂苷Rg1可显著提高Aβ_(1-40)损伤的h BMECs活性,减少细胞损伤后LDH的漏出和h BMECs RAGE的表达,与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论通络救脑注射液及其有效单体成分京尼平苷、人参皂苷Rg1可提高Aβ_(1-40)损伤的h BMECs的活性,对其具有保护作用,其机制可能与减少血管内皮细胞RAGE的表达有关。

通络救脑注射液对成年大鼠侧脑室室管膜下层Vimentin、GFAP阳性细胞的影响

目的:观察通络救脑注射液对成年大鼠侧脑室室管膜下层Vimentin、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞的作用。方法:采用Wistar成年雄性大鼠,去除大鼠左侧大脑皮层血管,应用免疫组化方法观察去皮层血管对侧脑室室管膜下区(SVZ)神经干细胞增殖、分化和迁移的影响,以及通络救脑注射液的作用。结果:通过连续切片的免疫组化结果显示去皮层血管后侧脑室SVZ的增殖细胞核抗原(PCNA)、Vimentin、GFAP阳性细胞均明显增多,反应增强,表象改变显著。此种损伤刺激引起了相对静止的SVZ神经干细胞增殖、分化,给予通络救脑注射液后促进以上各种阳性细胞表达增多、增强。结论:提示通络救脑注射液可能通过上调内源性促神经生长因子的表达促进去皮层血管后成年大鼠SVZ神经干细胞增殖、分化。

IGF1在脑缺血大鼠脑组织中的表达与通络救脑注射液的脑保护作用

目的:观察脑缺血模型大鼠血清及脑组织中IGF1蛋白表达水平,以及通络救脑注射液对该因子表达水平的影响,分析通络救脑注射液的脑保护作用途径。方法:以线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO),将SD大鼠随机分为空白对照组、模型组及通络救脑注射药组,分别在造模后12小时、24小时、3天、7天4个时间点采取动物血清和脑组织,以免疫组化、酶联免疫(ELISA)以及RTPCR的方法,分别检测IGF1的表达部位及定量检测该因子的蛋白及mRNA表达水平,并测定血清NSE含量。结果:IGF1在正常脑组织有表达,在脑缺血后24小时表达增多,此后随脑缺血时间的延长不断减少;通络救脑组IGF1各时间点表达均高于模型组。模型组血清NSE水平显著升高,各时间点与正常组均有显著差异,通络救脑注射液组血清NSE水平在12小时、1天和7天时显著低于模型组。结论:大鼠脑缺血损伤后IGF1表达减少与神经元的坏死有相关性,通络救脑注射液能够提高其表达水平,对缺血损伤的脑组织发挥保护作用。

通络救脑注射液及其单体成分对缺氧诱导损伤神经元的影响

目的探讨通络救脑注射液保护神经元的可能作用机制。方法制备小胶质细胞氧糖剥夺条件液、通络救脑条件液、栀子苷条件液、人参皂苷Rg1条件液,将神经元分为正常对照组、氧糖剥夺组、正常条件液组、氧糖剥夺条件液组、通络救脑条件液组、栀子苷条件液组、人参皂苷Rg1条件液组,其中正常对照组采用常规神经元培养液,氧糖剥夺组采用无糖DMEM培养液,其余5组按照处理条件分别使用对应的小胶质细胞条件培养液,条件培养液添加为100%,作用时长为6h。比较各组神经元细胞活性、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、神经元NMDAR1及caspase-3的表达水平。结果与正常对照组比较,氧糖剥夺组和氧糖剥夺条件液组神经元细胞活性明显下降,LDH漏出率明显增加,神经元NMDAR1和caspase-3表达均明显上升(P<0.05或P<0.01)。与氧糖剥夺组比较,通络救脑条件液组、栀子苷条件液组、人参皂苷Rg1条件液组神经元细胞活性明显提高,通络救脑条件液组和栀子苷条件液组LDH漏出率降低、NMDAR1表达明显下降(P<0.05或P<0.01),通络救脑条件液组、人参皂苷Rg1条件液组caspase-3表达明显下降(P<0.05或P<0.01)。结论通络救脑注射液及其单体成分(栀子、三七有效组分)可通过调节小胶质细胞的分泌成分,降低LDH漏出率及神经元NMDAR1、caspase-3的表达水平,提高神经元活性,逆转损伤小胶质细胞可能对神经元造成的影响,从而发挥神经元的保护作用,并且通络救脑注射液有整合调节的治疗优势。

不同状态的大鼠星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞血脑屏障特征性酶的影响

目的:探讨不同状态下大鼠星形胶质细胞(AS)条件培养液对脑微血管内皮细胞(BMEC)活性和血脑屏障特征性酶的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法:收集正常、激活、激活合并通络救脑注射液处理、损伤、损伤合并通络救脑注射液处理5种不同状态的星形胶质细胞条件培养液,分别作用于拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞,采用MTT法检测细胞活性,微量酶标仪法和上机比色法检测碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)的活性。结果:正常星形胶质细胞条件培养液能明显提高受损内皮细胞活性,诱导AKP、γ-GT活性增强,激活的星形胶质细胞条件培养液上述作用下降,而损伤后的星胶条件培养液对受损内皮细胞几乎无作用。通络救脑注射液作用于激活和损伤星形胶质细胞后,其条件培养液提高内皮细胞活性和AKP、γ-GT活性的作用显著增强。结论:正常AS的分泌产物对提高BMEC的活性和维持血脑屏障特性具有重要意义,AS受损后,该作用减弱或消失,通络救脑注射液可显著提高AS对受损BMEC活性和功能的保护作用,这可能是该药物发挥脑缺血性损伤后血脑屏障稳定作用的内在机制之一。