钙通道活性与胃泌素促人结肠癌细胞增殖间关系的研究

目的 探讨钙通道活性在胃泌素促人结肠癌细胞增殖中的作用。方法 运用流式细胞仪检测细胞内游离钙离子水平 ,MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 2 5× 10 -6M的五肽胃泌素 (PG)可以引起HT2 9细胞内游离钙离子水平明显升高 (P <0 0 1) ,钙通道阻滞剂nifedipine(10 -5M)可以使PG引起的钙离子水平升高幅度明显下降 (P <0 0 1)。同时可以部分抑制PG促增殖作用 (P <0 0 5 )。钙通道激动剂Bayk86 4 4 (10 -6M)可以明显升高细胞内钙离子水平 (P <0 0 1)。并能促进HT2 9细胞增殖 (P <0 0 5 ) ,与PG的促增殖作用相比无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 钙通道作为调节细胞内钙离子变化的主要途径 ,在调控PG促HT2

海南捕鸟蛛毒素-Ⅴ分离纯化及其抑制河豚毒敏感型钠通道活性研究

经阳离子交换和反相HPLC柱层析从海南捕鸟蛛 (Seleconosmiahainana)粗毒中分离到 1种新的神经毒素 ,命名为海南捕鸟蛛毒素 -Ⅴ (Hainantoxin Ⅴ ,HNTX Ⅴ ) ,MALDI TOF质谱鉴定分子量为 396 9 5Da。在全细胞记录膜片钳模式下 ,HNTX Ⅴ对成年大鼠背根神经节 (DRG)细胞河豚毒敏感型 (TTX S)钠电流有抑制作用 ,但对河豚毒不敏感型 (TTX R)钠电流无明显影响。HNTX Ⅴ对TTX S钠电流的抑制作用具有浓度依从性 ,其有效半抑制浓度 (IC50 )为 4 6 8nmol/L。HNTX Ⅴ不影响TTX S钠电流的激活相和失活相 ,对钠通道的激活阈值和最大激活电压也无明显改变 ,表明HNTX Ⅴ影响钠通道的作用机制明显有别于δ ACTXs等蜘蛛毒素。推测HNTX Ⅴ很可能类似于河豚毒、Saxitoxin和 μ conotoxins ,同样作用于钠通道的位点S1。

原发性高血压患者血压参数与血管平滑肌细胞钙激活钾通道活性的相关性研究

目的:探讨原发性高血压患者血压参数与血管平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)活性的相关性。方法:切取21例原发性高血压患者(高血压组)及18例非高血压者(血压正常组)的肠系膜动脉小分支节段,用酶消化法获取血管平滑肌细胞,以膜片钳技术检测KCa通道的活性,通过Pclamp专用软件实时采样记录其平均开放时间(To),平均关闭时间(Tc),平均开放概率(Po)等。采用美国Meditech公司的ABPM-04动态血压监护仪,记录24h平均收缩压、24h平均舒张压、24h平均脉压、白昼血压、夜间血压、脉压变异性。结果:①两组血压参数:高血压组24h平均收缩压与平均舒张压、白昼平均收缩压与平均舒张压、夜间平均收缩压与平均舒张压、24h平均脉压、脉压变异性均显著高于血压正常组;②两组KCa通道活性变化:两组于细胞内面向外膜片下,不同浓度Ca2+较Ca2+浓度为0时Po、To增加,Tc缩短,有显著性差异;③高血压组血管平滑肌KCa活性与血压参数的相关性:24h平均舒张压、白昼及夜间平均舒张压、24h平均脉压升高时,Po显著增加,To显著延长,Tc显著缩短。但24h平均收缩压、白昼及夜间平均收缩压、脉压变异性变化与Po、To、Tc关系不明显。结论:原发性高血压患者肠系膜动脉平滑肌KCa通道活性明显高于非高血压者,但对Ca2+的敏感性降低。原发性高血压患者舒张压、

钙通道活性与胃泌素促人结肠癌细胞增殖间关系的研究

目的 :探讨钙通道活性在胃泌素促人结肠癌细胞增殖中的作用。方法 :运用流式细胞仪检测细胞内游离钙离子水平 ,MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 :2 5× 10 -6M的五肽胃泌素 (PG)可以引起HT2 9细胞内游离钙离子水平明显升高 (P <0 0 1) ,钙通道阻滞剂nifedipine (10 -5M)可以使PG引起的钙离子水平升高幅度明显下降 (P <0 0 1)。同时可以部分抑制PG促增殖作用 (P <0 0 5 )。钙通道激动剂Bayk86 44 (10 -6M)可以明显升高细胞内钙离子水平 (P <0 0 1)。并能促进HT2 9细胞增殖 (P <0 0 5 ) ,与PG的促增殖作用相比无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 :钙通道作为调节细胞内钙离子变化的主要途径 ,在调控PG促HT2

家福捕鸟蛛毒素-22钠通道活性与基本性质分析

家福捕鸟蛛(Selenocosmia jiafu,S.jiafu)是一种生活在中国广西、云南等地的蜘蛛新种.研究发现其粗毒对大鼠背根神经节(Rat dorsal root ganglion,DRG)细胞河豚毒素不敏感型钠通道(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)具有抑制作用.为了筛选得到抑制TTX-R活性的毒素分子,经反相高效液相色谱,从家福捕鸟蛛粗毒中分离得到1种新的毒素分子,命名为家福捕鸟蛛毒素-22(Jiafu toxin-22,JFTX-22).MALDI-TOF质谱分析和氨基酸序列分析表明该多肽毒素分子量为2807.227 Da,全序列为RCLPSGKACAGVTQK IPCCGSCVRGKCS.全细胞膜片钳分析表明JFTX-22对DRG细胞TTX-R通道具有抑制作用.此外,采用生物信息学方法初步分析了JFTX-22的基本理化性质、空间结构预测和同源序列比对等.结果表明JFTX-22的全长cDNA为471bp,编码一个65个氨基酸残基多肽.JFTX-22的二级结构主要以无规卷曲为主,其空间结构主要包含无规卷曲和三段反平行beta-折叠.同源序列比对发现JFTX-22跟Covalitoxin-I序列完全一致,与另外三种蜘蛛毒素JZTX-51、U1-theraphotoxin-Pf3和HWTX-X同源性较高.结果表明JFTX-22是一种潜在的具有镇痛活性的新型毒素分子.

血管活性剂对高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道活性的调控作用

探讨血管活性剂内皮素-1（ET-1）及前列腺素E1（PGE1）对高血压病患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾（Kca）通道活性的调控作用。方法：切取21例老年高血压病患者及18例老年非高血压者肠系膜动脉小分支节段，用酶消化法获取血管平滑肌细胞，以膜片钳技术检测Kca通道的活性，通过Pclamp专用软件实时采样记录其平均开放时间（To），平均关闭时间（Tc），平均开放概率（Po）等。结果：（1）高血压病患者Kca通道活性变化，于细胞内面向外膜片下，高血压病组与血压正常组比较，前者Kca通道Po增加，Tc延长，To缩短。在浴液中分别加入Ca^2＋后，两组Kca通道均被明显激活，与加Ca^2＋前比较，血压正常组Po的增加显著高于高血压病组（P〈0．001），说明高血压病组Kca通道的敏感性显著低于血压正常组。（2）两组溶液中加入ET-12～8×10^9mol／L后，在内面向外式膜片下，血压正常组Po先增加后降低，Tc缩短，然而高血压病组患者肠系膜血管平滑肌Kca通道对ET-1则缺乏显著反应。（3）溶液中加入PGE1后，在内面向外膜片下，高血压病患者血管平滑肌细胞Kb通道的通道电导增加，To显著处长，Tc显著缩短，Po显著增加，并呈浓度依赖性。结论：（1）高血压病患者肠系膜动脉平滑肌细胞Kca通道活性明显高于非高血压者。但对Ca^2＋的敏感性降低。（2）ET-1对正常人动脉平滑肌细胞Kca通道活性呈浓度依赖的双重作用。而对高血压病患者Kca通道活性无明显影响。（3）PGE1可明显激活高血压病患者Kca通道。

兔急性心肌梗死后二月心室肌细胞钠离子通道活性的变化

研究急性心肌梗死 (AMI)后心室肌细胞钠离子通道活性的变化。采用结扎兔冠状动脉左前降支的方法建立AMI动物模型 ,应用膜片钳全细胞记录方法 ,观察AMI后 2个月心外膜梗死区心肌细胞钠通道电流 (INa)的变化。结果 :①正常对照组INa电流密度峰值 (去极化电位 - 30mV时 )为 45 .5± 5 .33pA/pF(n =12 ) ,心肌梗死 (简称心梗 )组为 16 .4± 4.43pA/pF(n =13) ,心梗组较对照组明显下降 ,P <0 .0 1。心梗组INa电流 电压关系曲线较对照组明显下移。②心梗组INa失活曲线较对照组明显左移 (即向超级化方向移动 ) ,对照组半数失活电压 (V0 .5)为 - 76 .2± 5 .3mV(n =5 ) ,心梗组V0 .5为 - 82 .4± 5 .6mV(n =12 ) ,P <0 .0 5。③心梗组钠通道灭活后恢复时程较对照组减慢 ,恢复曲线下移。结论 :AMI可导致梗死区心室肌细胞INa下降、钠通道动力学发生变化 ,引起心肌传导速度下降和不应性延长 ,此可能是导致AMI后出现折返性室性心律失常的原因。

基于特征筛选方法预测不同离子通道活性的芋螺毒素

芋螺毒素是一种具有丰富序列多样性且富含二硫键的多肽.因其能够特异性地结合离子通道,阻断神经冲动的传递,芋螺毒素又具有极大的潜在药用价值.面对庞大的芋螺毒素种类,需借助理论的手段和方法来进行研究,从而降低实验成本,为实验做出理论指导.本文基于二项式分布结合支持向量机算法对芋螺毒素离子通道活性类型进行了预测,jackknife交叉验证的总体精度和平均精度分别达到87.5%和86.8%.结果表明,本文所建模型能够用于芋螺毒素的离子通道活性预测,为基于芋螺毒素新药物的进一步开发提供帮助和理论依据.

蝙蝠葛苏林碱衍生物的合成及钙通道阻滞活性的研究

目的 :合成蝙蝠葛苏林碱衍生物 ,寻找优良的钙通道拮抗剂。方法 :从蝙蝠葛粗总碱中分离出蝙蝠葛苏林碱 ,对其酚羟基进行醚化和酯化 (或选择性酯化 ) ,并测定其中一些衍生物的钙通道阻滞活性。结果 :合成了 15个蝙蝠葛苏林碱衍生物 ,其结构经IR、1HNMR、MS得到确证 ;6个衍生物具有一定的钙通道阻滞活性 ,化合物DS5具有比蝙蝠葛苏林碱、汉防己甲素和异博定更强的钙通道阻滞活性。结论

11,12-表氧化二十碳三烯酸对COPD大鼠气道平滑肌细胞钙激活性钾通道的作用

目的观察COPD大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)的钙激活性钾通道(KCa)的活性变化,以及11,12表-氧化二十碳三烯酸(11,12-EETs)对气道平滑肌细胞KCa的作用。方法40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组和COPD组,每组20只。在相对密闭舱内吸入纸烟建立COPD动物模型,采用急性酶分离法分离大鼠ASMCs,应用膜片钳技术,分离出KCa电流,测定KCa开放概率(Po)、平均开放时间(To)和平均关闭时间(Tc)。比较COPD组和正常对照组KCa上述活性指标的变化,以及应用3μmol/L的11,12-EETs对COPD组ASMCs细胞进行灌流后KCa活性的变化。结果与正常对照组比较,COPD组ASMCs的KCa通道Po明显降低(0.084±0.028比0.198±0.029,P<0.01),To显著缩短[(0.732±0.058)m s比(1.648±0.152)m s,P<0.01],Tc显著延长[(12.259±2.612)m s比(6.753±1.237)m s,P<0.01]。而用11,12-EETs灌流ASMCs细胞后可明显激活KCa活性,Po增加(0.227±0.059比0.084±0.028,P<0.01),To延长[(2.068±0.064)m s比(0.732±0.058)m s,P<0.01],Tc缩短[(4.273±0.978)m s比(12.259±2.612)m s,P<0.01]。结论COPD大鼠ASMCs细胞KCa通道活性降低可能在COPD发病机制中起着一定作用,11,12-EETs可以直接激活COPD大鼠ASMCs细胞KCa活性,提高膜电位稳定性,从而松弛COPD大鼠气道平滑肌。

脱氢表雄甾酮对慢性阻塞性肺病大鼠气管平滑肌细胞钙激活性钾通道的影响

目的研究脱氢表雄甾酮(DHEA)对慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠支气管平滑肌细胞(BSMCs)钙激活性钾通道(Kca)的作用。方法 60只大鼠平均分为正常对照组COPD组,DHEA+COPD组,每组20只,在相对密闭的舱内吸入纸烟120 d建立COPD动物模型,DHEA+COPD组以DHEA(30 mg.kg-1.d-1)灌胃,以免疫组化检测Kca蛋白表达,以模片钳检测大鼠气道平滑肌细胞Kca通道活性。结果与正常对照组比较,COPD组大鼠Kca蛋白表达下调,其活性下降,而DHEA干预组Kca活性明显恢复,蛋白表达上调。结论 DHEA干预能使COPD大鼠气道平滑肌细胞Kca活性和蛋白表达恢复,可能在防治COPD形成中起着一定的作用。

钙激活性氯离子通道与高肺血流性肺动脉高压

高肺血流性肺动脉高压的形成主要是由于长期异常血流动力学改变引起肺动脉内皮损伤、肺动脉中膜平滑肌舒缩功能障碍和肺血管结构重构，进而使血管内径变小，肺血管阻力增加，其中肺动脉平滑肌收缩是重要的成因。

腺苷对海马神经元高电压激活性钙通道电流的作用研究

目的:在细胞水平研究腺苷(Ade)对海马神经元高电压激活性钙通道电流(IHVA)的影响。方法:条件培养基纯化法原代培养SD大鼠乳鼠的海马神经元,选取生长7～9d的细胞,应用全细胞膜片钳技术,以细胞外给予Ade的方法,比较Ade干预前后IHVA值及I-V曲线的变化,并观察硝苯地平预处理后,Ade对IHVA值影响的改变。结果:原代培养的SD大鼠乳鼠的海马神经元在7～9d发育基本成熟,采用膜片钳技术在预设的刺激程序下可以记录到IHVA,以细胞外干预的方式加入Ade后,观察到Ade可抑制IHVA的幅度,并呈浓度依赖性,可使I-V曲线上移,但对最大激活电位及峰值电位无明显影响;硝苯地平可部分减弱Ade对IHVA的影响。结论:Ade在一定浓度时可显著抑制体外培养海马神经元的IHVA,硝苯地平可部分减弱这种影响。

中电导钙激活性钾通道在人多发性骨髓瘤细胞增殖中的作用

目的探讨中电导钙激活性钾通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels,IKCa1)在人多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞增殖中的作用。方法通过台盼蓝拒染法检测IKCa1阻滞剂CLO对MM细胞株RPMI 8226和U266生存活力的影响,应用流式细胞仪检测CLO作用于RPMI 8226和U266细胞后细胞周期分布及细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)变化。结果 CLO以浓度依赖方式显著抑制RPMI 8226和U266细胞生长,10μmol/L CLO作用48 h后,RPMI 8226细胞和U266细胞周期明显被阻滞于G0/G1期,S期显著减少。10μmol/L CLO作用1min后,RPMI 8226和U266细胞内Fluo-3/AM荧光强分别为(448.3±32.8)和(675.9±45.8),分别与对照组(56.5±7.2)和(31.8±4.5)相比具有显著差异(P<0.05)。结论钙激活性钾通道阻断剂克霉唑抑制MM细胞增殖,其机制可能与CLO通过调节细胞内钙水平引起细胞周期阻滞于G0/G1期有关。

ERK1/2通路在低氧上调大鼠PASMCs钙激活性氯离子通道表达的作用

目的:探讨钙激活性氯离子通道(CLCA2)在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中m RNA和蛋白表达的变化及其与ERK1/2信号通路的关系。方法:PASMCs随机分为:常氧组(N组),低氧组(H组),DMSO对照组(D组),U0126干预组(U组),Staurosporine aglycone干预组(SA组),采用免疫印迹法检测CLCA2蛋白的表达;选用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定CLCA2 m RNA水平的表达。结果:PASMCs中CLCA2m RNA和蛋白的表达量,H组较N组明显上调(P<0.01);U组较D组明显上调(P<0.01);SA组较D组m RNA的表达显著下调(P<0.01),蛋白的表达轻微下调。结论:低氧可上调CLCA2中m RNA和蛋白在PASMCs的表达;ERK1/2通路激活剂-Staurosporine aglycone能下调CLCA2在PASMCs中m RNA和蛋白的表达量;ERK1/2通路抑制剂-U0126可上调CLCA2在PASMCs中m RNA和蛋白的表达量。

甘氨脱氧胆酸对肝细胞钙激活性钾通道的影响

目的 观察甘氨脱氧胆酸 (GDC)对大鼠肝细胞钙激活性钾通道 (KCa)开放概率的影响。方法 体外培养大鼠肝细胞 ,以 GDC为处理因素 ,应用膜片钳技术通过贴附式和内面向外式膜片测定大鼠 KCa开放概率。结果 1细胞贴附式膜片下 ,浴液中 Ca2 +浓度 10 - 7mol/ L,GDC终浓度为 5 0 ,10 0 ,2 5 0 μmol/ L 时 ,概率由 0 .0 38± 0 .0 9分别增加到 0 .6 2 0±0 .338,0 .5 91± 0 .16 3,0 .895± 0 .176 (n=4,P均 <0 .0 1)。浴液中不加 GDC,改变 Ca2 +浓度 (10 - 7、10 - 6、10 - 5 mol/ L) ,KCa的开放概率并不发生明显改变 ,而在此液中加入 GDC(终浓度 10 0 μmol/ L) ,KCa开放概率由 0 .0 42± 0 .0 15增加到 0 .385±0 .330和 0 .5 5 1± 0 .16 3(n=4,P均 <0 .0 5 )。浴液中不含 Ca2 + ,并加入 EGTA,GDC浓度为 5 0 ,10 0 ,2 5 0 μmol/ L,KCa开放概率显著增加 (n=4,P均 <0 .0 5 ) ,但比浴液中有 Ca2 + 时增加程度小。 2内面向外式膜片下 ,浴液中无 Ca2 + ,加入 GDC(10 ,5 0 ,10 0 ,2 5 0μmol/ L ) ,KCa开放概率无明显改变 (n=2 ,P>0 .0 5 )。结论 1GDC对 KCa有明显的激活作用 ,并有浓度依赖性。 2 GDC既有引起胞外 Ca2 +内流 ,也能诱导内贮 Ca2 +的释放。 3GDC对 KCa的激活是通过 Ca2 +实现的。

容量激活性氯离子通道在低氧高二氧化碳处理的大鼠PASMCs的表达及其与MAPK通路的关系

目的:探讨容量激活性氯离子通道(CLC3)在低氧高二氧化碳处理的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中的表达变化及其与MAPK信号通路的关系。方法:酶消化法取雄性SD大鼠PASMCs进行原代培养,采用小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光细胞化学法进行细胞鉴定;复制低氧高二氧化碳模型,采用免疫印迹法检测CLC3蛋白的表达;采用RT-PCR技术测定CLC3 mRNA水平的表达。结果:(1)与对照组比较,低氧高二氧化碳组PASMCs CLC3 mRNA和蛋白表达量均显著上调(均P<0.01);(2)与低氧高二氧化碳组比较,ERK抑制剂U0126+低氧高二氧化碳组PASMCs CLC3 mRNA和蛋白表达量均显著下调(均P<0.01);p38抑制剂SB203580+低氧高二氧化碳组PASMCs CLC3 mRNA和蛋白表达量均明显上调(均P<0.01);p38激活剂茴香霉素+低氧高二氧化碳组PASMCs CLC3 mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05和P<0.01)。结论:低氧高二氧化碳可上调大鼠PASMCs CLC3 mRNA和蛋白的表达;ERK1/2通路介导了低氧高二氧化碳诱导的大鼠PASMCs CLC3表达,而p38 MAPK通路活化则下调低氧高二氧化碳诱导的CLC3 mRNA和蛋白表达。

二十二碳六烯酸对大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活性钾通道的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)上大电导钙激活性钾通道(BKCa)的影响。方法采用酶消化法获得大鼠CASMCs,用膜片钳技术分别记录0,10,20,40,60和80μmol/LDHA对大鼠CASMCs上BKCa通道动力学的影响。结果在不同浓度DHA作用下,IBKCa和BKCa尾电流均呈浓度依赖性增加。IBKCa和BKCa尾电流I-V曲线均上移,对IBKCa稳态激活曲线无影响。在指令电压+150 mV,不同浓度DHA作用下,IBKCa电流密度分别为68.24±22.75,72.40±24.49,120.44±37.96,237.48±53.22,323.60±74.83和370.61±88.16pA/pF(P<0.05,n=20)。DHA对IBKCa激活的药物半效浓度为36.22±2.17μmol/L。在测试电压+90 mV,不同浓度DHA作用下,BKCa尾电流密度分别为91.02±13.52,100.23±17.34,224.02±38.76,369.19±65.39,511.39±82.77和700.14±96.64 pA/pF(P<0.05,n=20)。结论 DHA对全细胞BKCa有激活作用,对稳态激活曲线无影响。DHA对BKCa通道的激活作用可能是其舒张血管机制之一。