弓形虫SAG1、ROP18真核表达载体的构建及在诱导小鼠保护性免疫中的作用研究

目的观察弓形虫速殖子表面抗原1(SAG1)、棒状体蛋白18(ROP18)真核表达载体单独及联合使用诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法制备重组真核表达质粒p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-SAG1,p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-ROP18及空质粒p3×FLAG-Myc-CMV TM-24(空载体),以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1μg/μL。将102只BALB/c小鼠随机分成6组,每组17只,前4组分别注射PBS(PBS对照组)、空载体(空载体对照组)、SAG1载体(SAG1组)、ROP18载体(ROP18组)各100μL,其余两组均注射SAG1与ROP18对半混合载体,分别注射量为200μL(全量混合组)、100μL(半量混合组),每组间隔2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫4周后,各组随机取7只小鼠,无菌条件下取脾,流式细胞术检测小鼠脾脏CD4^(+)、CD8^(+)T细胞亚群分布,荧光定量PCR分析各组小鼠脾细胞中细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)的表达;每组其余10只小鼠腹腔接种1×103个弓形虫速殖子,观察各组小鼠的生存时间。结果各组小鼠脾脏CD4^(+)T细胞比例差异无统计学意义(P>0.05);与PBS对照组比较,SAG1组、ROP18组、全量混合组、半量混合组、空载体对照组CD8^(+)T细胞比例明显升高(P<0.01),半量混合组较其他组更高(P<0.05)。半量混合组、全量混合组CD4^(+)/CD8^(+)较两对照组(PBS对照组和空载体对照组)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。全量混合组、半量混合组小鼠脾细胞中IL-12、IFN-γ相对表达水平与两对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且半量混合组IFN-γ相对表达水平与ROP18组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但各组间IL-4相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。弓形虫速殖子攻击感染小鼠试验中两单基因疫苗组(SAG1组和ROP18组)、全量混合组、半量混合组均较两对照组生存时间延长(P<0.05),且半量混合组较全量混合组生存时间也显著延长(P<0.01),但全量混合组与两单基因疫苗组差异无统计学意义(P>0.05)。结论弓形虫DNA重组载体能诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫应答及部分抗虫免疫保护作用,且构建的两种真核载体在合适浓度联合免疫能诱导小鼠产生更强的免疫保护作用。