慢性阻塞性肺疾病患者外周血中冷诱导RNA结合蛋白和髓样细胞触发受体-1的表达水平及其临床意义

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血中冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)和髓样细胞触发受体-1(TREM-1)的表达水平及其临床意义。方法选取2022年10月—2023年6月40例住院的COPD患者为急性加重期组,其经过治疗进入稳定期后纳入稳定期组,同期40例健康体检者为对照组。收集各组一般资料,采集外周血,通过酶联免疫吸附法测定血浆中CIRBP、TREM-1水平,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法测定CIRBP mRNA和TREM-1 mRNA的相对表达量,并检测COPD患者和健康体检者的肺功能。结果COPD急性加重期外周血中的CIRBP、TREM-1表达水平均高于稳定期组,差异有统计学意义(均P<0.001);急性加重期和稳定期外周血中的CIRBP、TREM-1表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.001);在急性加重期和稳定期,CIRBP水平均与TREM-1水平呈正相关;急性加重期CIRBP、TREM-1水平与白细胞计数、中性粒细胞百分比、中性粒细胞/淋巴细胞比率呈正相关;稳定期CIRBP、TREM-1水平与第1秒用力呼气容积占预计值百分比、第1秒用力呼气容积/用力肺活量比值呈负相关,与白细胞计数、中性粒细胞百分比、中性粒细胞/淋巴细胞比率呈正相关。结论CIRBP和TREM-1的表达水平在COPD患者外周血中升高,CIRBP的表达与TREM-1表达具有相关性,并且与肺功能、白细胞计数、中性粒细胞百分比、中性粒细胞与淋巴细胞比率、单核细胞与高密度脂蛋白比率等临床指标相关,提示CIRBP和TREM-1可能共同参与COPD的发生发展。

速激肽-1受体小干扰RNA对变应性鼻炎多种炎性因子表达的影响

目的探讨速激肽-1受体小干扰RNA(neurokinin-1 receptor small interfering RNA,NK-1R-siRNA)对变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)鼻黏膜多种炎性因子表达的影响。方法将24只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法随机分为3组,分别为NK-1R-siRNA组、阴性小干扰RNA (negative control-small interfering RNA,NC-siRNA)组和生理盐水组,每组8只。将所有大鼠用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)建立AR动物模型,同时用NK-1R-siRNA、NC-siRNA和生理盐水滴鼻干预。观察各组大鼠的AR症状。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清中OVA特异性IgE。实时定量聚合酶链反应(real time PCR,RT-PCR)及免疫组织化学(免疫组化)法检测各组大鼠鼻黏膜中NK-1R的表达情况。通过蛋白芯片技术比较各组大鼠鼻黏膜局部炎性因子的表达。使用SPSS 11.0软件,以单因素方差分析进行数据分析。结果与生理盐水组比较,NK-1R-siRNA组大鼠AR症状明显缓解[挠鼻(31.4±8.9)次/15 min比(69.5±17.9)次/15 min,喷嚏(7.2±1.9)次/15 min比(23.7±9.2)次/15 min,鼻分泌物(7.1±2.3)mg比(24.1±4.4)mg,t值分别为38.100、17.125、16.837,P值均<0.01]。与生理盐水组比较,NK-1R-siRNA组大鼠血清中OVA特异性IgE水平明显降低[(8.56±0.73)ng/ml比(18.05±1.22)ng/ml,t=9.787,P<0.01]。RT-PCR和免疫组化显示NK-1R-siRNA组大鼠鼻黏膜中NK-1R表达较NC-siRNA组和生理盐水组显著下降。蛋白芯片结果显示NK-1R-siRNA干预后,AR大鼠鼻黏膜中白细胞介素(interleukin,IL)1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13等多种炎性因子表达受到抑制,而γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-10的表达明显升高。结论 NK-1R-siRNA可通过调节多种AR相关炎性因子的表达,减轻鼻黏膜局部变应性炎症。

lncRNA DSCAM-AS1通过miR-144-5p/IRS2轴对甲状腺乳头状癌细胞的影响

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)唐氏综合征细胞黏附分子反义1(DSCAM-AS1)通过微小RNA(miR)-144-5p/胰岛素受体底物2(IRS2)轴促进甲状腺乳头状癌(PTC)细胞生长和侵袭的作用。方法:将PTC细胞株TPC-1随机分为对照组(Control组,完全培养基正常培养)、si-NC组(转染si-NC)、si-DSCAM-AS1组(转染si-DSCAM-AS1)、si-DSCAM-AS1+inhibitor NC组(si-DSCAM-AS1与inhibitor NC共转染)、si-DSCAM-AS1+miR-144-5p inhibitor组(si-DSCAM-AS1与miR-144-5p inhibitor共转染)。RT-qPCR法检测DSCAM-AS1、miR-144-5p和IRS2 mRNA的表达;CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞的侵袭能力;Western blot检测IRS2蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系。结果:与Control组相比,si-DSCAM-AS1组TPC-1细胞DSCAM-AS1表达、吸光度(A450)值、细胞侵袭数目、IRS2表达显著降低(P<0.05),miR-144-5p表达显著升高(P<0.05)。与si-DSCAM-AS1组相比,si-DSCAM-AS1+miR-144-5p inhibitor组A450值、细胞侵袭数目、IRS2表达显著升高(P<0.05),miR-144-5p表达显著降低(P<0.05)。DSCAM-AS1靶向负调控miR-144-5p表达,miR-144-5p靶向负调控IRS2表达。结论:沉默DSCAM-AS1可能通过上调miR-144-5p来抑制IRS2蛋白的表达,从而抑制PTC细胞生长和侵袭。

表达PD-1 shRNA增强靶向CD19 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力

目的:设计和构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞并验证其体外肿瘤细胞杀伤能力。方法:设计并构建表达PD-1 shRNA的CD19 CAR分子基因,将其包装成逆转录病毒载体,通过qPCR法检测病毒载体拷贝数。将慢病毒转导人原代T细胞,获得三种CAR-T细胞,分别为RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞。采用qPCR法检测三种CAR-T细胞中PD-1 mRNA的表达水平,流式细胞术检测三种CAR-T细胞中PD-1表达水平,萤光素酶报告基因实验、流式细胞术检测在不同效靶比时CAR-T细胞对CD19阳性靶细胞(人淋巴瘤daudi细胞)的杀伤功能。结果:RNAU6-CD19 CAR、PD-1 shRNA1-CD19 CAR、PD-1 shRNA2-CD19 CAR三种CAR分子成功包装成逆转录病毒载体,病毒载体拷贝数均高于1×10^(7)拷贝/mL,转导人原代T细胞获得CAR-T细胞,RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞转导效率分别为43.1%、55.1%、41.7%。与RNAU6-CD19 CAR-T细胞相比,PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞中PD-1 mRNA表达水平均显著降低(均P<0.01)、细胞表面PD-1表达水平更低(均P<0.01)、体外对daudi细胞的杀伤率更高(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞,其对CD19阳性靶细胞的杀伤率显著提高,PD-1 mRNA及其翻译产物PD-1的表达减少,CAR-T细胞的耗竭减缓。

RNA干扰维生素D受体基因表达对HK-2细胞中钠/二羧酸协同转运蛋白1表达的影响

目的细胞水平上检测干扰维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因表达对钠/二羧酸协同转运蛋白1(Na(+)-dicarboxylate cotransporter,NaDC)在HK-2细胞中的表达的影响,探讨VDR与NaDC1在尿枸橼酸调控中的关系。方法设计6条VDR基因的siRNA,用脂质体法转染人肾近曲小管上皮HK-2细胞株,通过qPCR和Western Blot检测HK-2细胞VDR m RNA和蛋白质的表达水平,筛选有效的siRNA,用以转染HK-2细胞株,通过qPCR和WB检测细胞株中NaDC1 m RNA和蛋白的表达水平。结果siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4能够显著降低VDRmRNA和蛋白质表达水平(P<0.05),用以后续实验发现siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4组NaDC1的m RNA和蛋白质表达水平显著降低(P<0.05)。结论在HK-2细胞中,在一定表达水平范围内,VDR调控NaDC1的表达,两者表达水平呈正相关。由于VDR的表达上调引起了NaDC1的表达也相应上调,从而使NaDC1的转运活性增加,尿枸橼酸在肾近曲小管的重吸收也增加,表现为低枸橼酸尿症。

miR-155-5p通过调控心肌细胞焦亡对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响及机制研究

目的探讨微小RNA(miR)-155-5p对心肌缺血-再灌注损伤(IRI)大鼠心肌细胞焦亡的影响及机制。方法60只SD大鼠随机分为假手术(sham)组、IRI组、agomir-NC组、miR-155-5p agomir组、antagomir-NC组和miR-155-5p antagomir组,每组10只。采用超声心动图仪测定大鼠左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)。酶联免疫吸附试验检测大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)水平,心肌组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-18和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;苏木素-伊红染色观察大鼠心肌组织病理学变化;实时荧光定量聚合酶链反应检测大鼠心肌组织miR-155-5p和沉默信息调节因子1(SIRT1)信使RNA(mRNA)表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-155-5p与SIRT1的靶向关系;蛋白质印迹法检测大鼠心肌组织SIRT1、NOD样受体蛋白3(NLRP3)、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Cleaved Caspase-1)和GSDMD蛋白表达水平。结果与sham组比较,IRI组大鼠LVEDD和LVESD升高,LVEF和LVFS降低,血清CK-MB、LDH和cTnT水平升高,心肌组织IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平升高,心肌组织结构破坏严重,心肌纤维排列紊乱,NLRP3、Cleaved Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量升高,SIRT1蛋白相对表达量降低(均为P<0.05/5)。与IRI组比较,miR-155-5p agomir组大鼠LVEDD和LVESD升高,LVEF和LVFS降低,血清CK-MB、LDH和cTnT水平升高,心肌组织中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平升高,心肌组织病变程度加重,NLRP3、Cleaved Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量升高,SIRT1蛋白相对表达量降低;miR-155-5pantagomir组大鼠LVEDD和LVESD降低,LVEF和LVFS升高,血清CK-MB、LDH和cTnT水平降低,心肌组织中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平降低,心肌组织病变程度减轻,NLRP3、Cleaved Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量下降,SIRT1蛋白相对表达量升高(均为P<0.05/5)。miR-155-5p与SIRT1在大鼠心肌组织中的表达水平呈负相关,且SIRT1是miR-155-5p的靶基因。结论miR-155-5p可能通过靶向下调SIRT1促进NLRP3介导的心肌细胞焦亡参与调节大鼠心肌IRI。

溃疡性结肠炎患者血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表达水平及与预后相关性研究

目的探讨长链非编码RNA心肌梗死相关转录本2(long non-coding RNA myocardial infarction-related transcript 2,LncRNA Mirt2)、长链非编码RNA干扰素γ-反义RNA1(long non-coding RNA interferonγ-antisense RNA 1,LncRNA IFNG-AS1)在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者血清中表达情况及与UC患者预后相关性。方法选择2018年12月~2021年1月南京市浦口区中医院(南京市中医院浦口分院)收治的193例UC患者作为观察对象,其中缓解期85例,活动期108例。根据患者预后情况分为复发组(n=78)和未复发组(n=115),另选取同期190例健康体检者作为对照组。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表达水平,Pearson法分析UC患者血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表达水平相关性及LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1与C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、白细胞介素-6(interleukin-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的相关性;ROC曲线分析血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1对复发UC的诊断价值。结果与对照组比较,缓解期组与活动期组UC患者血清LncRNA Mirt2(0.92±0.10,0.71±0.08vs 1.07±0.12)表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1(1.63±0.25,2.27±0.42 vs 1.01±0.14)表达水平及CRP(13.42±4.71mg/L,25.38±6.29 mg/L vs 4.32±1.27 mg/L),IL-6(8.31±2.35pg/ml,16.55±4.52 pg/mlvs 2.87±0.78 pg/ml),TNF-α(15.38±4.29 pg/ml,28.94±6.37 pg/ml vs 8.42±1.63 pg/ml)水平升高,差异具有统计学意义(t=10.064~44.632,均P<0.001);与缓解期组相比,活动期组UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1表达水平及CRP,IL-6,TNF-α水平升高,差异具有统计学意义(t=12.420~16.844,均P<0.001);与轻度组比较,中、重度组UC患者血清LncRNA Mirt2(0.69±0.08,0.58±0.05 vs 0.81±0.06)表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1(2.25±0.48,2.83±0.25 vs 1.90±0.31)表达水平升高,差异有统计意义(t=3.890~17.225,均P<0.001);与中度组比较,重度组UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1表达水平升高,差异具有统计学意义(t=6.184,5.957,均P<0.001)。相关性分析显示,UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平与CRP,IL-6和TNF-α呈负相关(r=-0.623,-0.605,-0.571,均P<0.001),LncRNA IFNG-AS1表达水平与CRP,IL-6和TNF-α呈正相关(r=0.457,0.531,0.497,均P<0.001)。与未复发组比较,复发组UC患者血清LncRNA Mirt2(0.70±0.08 vs 0.87±0.11)表达水平显著降低,LncRNA IFNG-AS1(2.38±0.41 vs 1.72±0.28)表达水平显著升高(t=11.706,13.294,均P<0.001);血清LncRNA Mirt2,LncRNA IFNG-AS1联合诊断复发UC的曲线下面积为0.931(95%CI:0.886~0.963),敏感度和特异度分别为87.18%,86.96%;阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为81.93%,90.91%和87.05%。结论UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平降低、LncRNA IFNG-AS1表达水平升高,与炎症水平和患者预后有关,可作为反映UC患者病情与预后的标志物。

干扰RNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对骨肉瘤细胞VEGF表达的影响

背景与目的:研究表明H IF-1α是肿瘤适应低氧微环境、诱导血管新生的一个主要调控因子。本研究通过观察体外低氧培养条件下骨肉瘤细胞系SaOS-2中H IF-1α和VEGF的表达,探讨H IF-1α在骨肉瘤缺氧激活血管新生调控途径中的作用。方法:CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境。半定量RT-PCR和免疫组化法分别检测不同缺氧时相中H IF-1α和VEGF在m RNA和蛋白水平的表达。构建针对H IF-1α的短发夹状小干扰RNA真核表达载体并转染SaOS-2细胞。免疫印迹沉淀观察转染后H IF-1α的基因沉默效果,RT-PCR和ELISA双抗体夹心法检测H IF-1α短基因沉默后SaOS-2细胞中VEGF的变化。结果:低氧条件下,SaOS-2细胞H IF-1αm RNA水平稳定,蛋白表达显著升高;而VEGF m RNA和蛋白的表达均显著升高。构建的H IF-1α短发夹状小干扰RNA表达载体转染SaOS-2细胞后能够显著下调H IF-1α基因的表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论:缺氧促使SaOS-2细胞H IF-1α在蛋白水平表达升高,H IF-1α通过转录激活VEGF的机制促进骨肉瘤缺氧状态下的血管新生。

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞糖酵解相关基因表达的影响

目的:探讨常氧及缺氧培养对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及糖酵解相关基因表达的影响。方法:选择3组细胞分别为食管鳞癌Eca-109细胞稳定转染HIF-1α siRNA及空质粒的Eca-109细胞,予以常氧和缺氧培养,缺氧培养时间分别为6、12、24、48h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白表达,Western blot和RT-PCR检测3组细胞常氧和缺氧条件下糖酵解相关基因(Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ)的表达,分光光度法分别测定3组细胞常氧和缺氧培养下胞液中乳酸脱氢酶(LDH)、己糖激酶(HK)酶活性。结果:Eca-109细胞缺氧条件下培养,HIF-1α蛋白表达较常氧时增高,干扰细胞常氧下HIF-1α几乎无表达,缺氧后亦无增强。常氧和缺氧条件下,干扰细胞Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ mRNA和蛋白表达较未干扰细胞明显减弱(P<0.05),干扰细胞胞液LDH、HK活性较未干扰细胞明显减少(P<0.05)。结论:RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达,进而不同程度减少Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ糖酵解相关基因的表达。

慢性乙肝患者外周血单个核细胞中CXCR1、CXCR2及IL-8 mRNA表达与干扰素治疗关系

目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染患者外周血单个核细胞(PBMC)中CXCR1、CXCR2及IL-8 mRNA表达水平及与α干扰素(IFN-α)治疗的关系。方法:采用实时定量PCR法动态观察30例慢性乙型肝炎患者接受IFN-α治疗前、治疗3个月、6个月后其外周血单个核细胞CXCR1、CXCR2及IL-8 mRNA表达水平。结果:治疗前慢性乙肝患者CXCR1、CXCR2及IL-8 mRNA表达水平分别为(0.44740.0386)、(0.4720 0.0458)、(1.1897 0.1028),均高于正常对照组(n=36),其中CXCR1及IL-8 mRNA水平升高显著,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗过程中CXCR1、CXCR2及IL-8表达水平均显著下降。IFN-α治疗6个月后CXCR1、CXCR2及IL-8 mRNA表达水平分别为(0.41290.0395)、(0.4461 0.0477)、(0.8660 0.1307),与治疗前相比,差异有显著性(P<0.01或P<0.05)。治疗前的CX-CR1、CXCR2及IL-8的表达水平在HBV高复制组(HBV-DNA>106,n=22)明显高于HBV低复制组(HBV-DNA<106,n=8),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:慢性乙肝患者外周血单个核细胞中CXCR1和IL-8表达水平显著升高,在干扰素治疗后,其表达水平下调,证明其可能与慢性乙肝炎症的发生机制相关。

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对胃癌细胞生物学行为的影响

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胃癌细胞增殖﹑凋亡﹑侵袭性的影响并探讨其可能的分子机制。方法:将HIF-1α短发夹RNA(shRNA)重组质粒pGCsi-shHIF-1α稳定转染人胃癌细胞SGC-7901;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平,Western blot法检测葡萄糖转运蛋白1(Glut-1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及趋化因子受体CXCR4蛋白表达;MTT法、流式细胞仪、transwell试验分别检测转染细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移能力。结果:稳定转染pGCsi-shHIF-1α后,SGC-7901细胞HIF-1α表达在mRNA及蛋白水平均受到明显抑制,Glut-1﹑MMP-2﹑CXCR4蛋白表达较对照组降低;细胞增殖能力较对照组明显降低,细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);细胞体外侵袭迁移能力受到明显抑制(P<0.01)。结论:pGCsi-shHIF-1α能有效沉默胃癌细胞SGC-7901 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭并诱导其凋亡,提示HIF-1α可能通过上调Glut-1﹑MMP-2和CXCR4等从而调节肿瘤细胞生长及转移。

RNA干扰选择性下调心肌细胞血管紧张素Ⅱ受体AT_(1a)

目的用RNA干扰技术选择性下调乳鼠心肌细胞上血管紧张素Ⅱ1a型受体(AT1aR)的表达。方法用携带U6启动子和AT1a特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体pAT1a-shRNA1,pAT1a-shRNA2,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesil-Con(pCon),转染原代培养的乳鼠心肌细胞,通过半定量RT-PCR和Western-blot法检测AT1a,AT2受体的表达情况,以内参照β-actin进行标化。结果pAT1a-shRNA1使AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低70%和67%,pAT1a-shRNA2使之分别降低66%和52%,转染对照质粒组较空白对照组AT1a受体表达及各组AT2受体表达无显著差异。结论RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌细胞AT1a受体的表达,为心血管疾病基因治疗的研究提供了新的思路。

RNA干扰介导的胶质瘤细胞IGF-1R基因下调诱导肿瘤细胞凋亡

目的应用RNA干扰(RNAi)技术介导胶质瘤C6细胞株胰岛素生长因子1受体(IGF1R)基因下调诱导C6细胞凋亡的研究。方法体外化学合成靶向IGF1R基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C6细胞,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组:同时使用绿色荧光素标记的小干扰RNA(FITCsiRNA)转染细胞,荧光显微镜下观察siRNA转染效率;RT-PCR法半定量检测siRNA对IGF1R基因表达的抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见细胞质内清晰的绿色荧光,脂质体OligofectamineTM2000的转染效率接近100%;化学合成的siRNA明显抑制IGF1RmRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF1RmRNA表达水平可下调约10%～80%,流式细胞术检测细胞凋亡率转染组为22.47%±3.15%,与阳性对照组2.3%±0.9%和阴性对照组1.14%±0.79%比较有明显提高,而阳性、阴性对照组相比无明显差异。结论化学合成的靶向IGF1R的siRNA可以明显下调IGF1R基因的表达,胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。

RNA干扰沉默低氧诱导因子-1α对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

本研究应用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)干扰寡核苷酸(siRNA)序列插入真核表达载体中,构建出特异性HIF-1α基因RNA干扰(RNAi)真核表达载体。采用组织块种植法,原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs),将构建出的特异性HIF-1α RNAi真核表达载体转染到PASMCs;分别在常氧和低氧下进行细胞培养,采用RT-PCR检测PASMCs HIF-1α mRNA表达水平, 用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖水平,探讨低氧条件下HIF-1α RNAi真核表达载体对PASMCs增殖的影响。结果表明,低氧培养48 h后,正常PASMCs和转染了HIF-1α siRNA阴性表达载体的细胞增殖显著,HIF-1α mRNA表达水平也显著升高;而转染了HIF-1α siRNA阳性表达质粒的细胞增殖不显著,HIF-1α mRNA表达水平较低。结果提示:HIF- 1α RNAi真核表达载体能显著干扰培养的PASMCs HIF-1α mRNA表达,同时抑制低氧环境下PASMCs的增殖。

RNA干扰HIF-1α表达对白血病K562细胞高三尖杉酯碱敏感性的影响

背景与目的:缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是细胞对缺氧应答的一个重要的转录因子,目前对缺氧条件下血液系统恶性肿瘤,尤其是白血病生物学改变的研究相对较少。本研究探讨应用RNA干扰技术抑制HIF-1α在慢性粒细胞白血病细胞系K562中的表达后,细胞对化疗药物高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)敏感性的变化。方法:利用shRNA表达载体pSilencer2.1-U6hygro构建RNA干扰载体,在K562细胞中抑制HIF-1α的表达,潮霉素筛选获得阳性克隆。应用实时定量RT-PCR技术研究缺氧(1%O2分压)条件下,抑制HIF-1α的表达对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)、葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter-1,Glut-1)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达的影响。应用MTT比色法观察抑制HIF-1α表达后,K562细胞对HHT敏感性的变化。结果:转染后HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表达均被抑制,缺氧条件下HIF-1α的靶基因VEGF、PGK、Glut-1、P-gp等表达明显下调。HIF-1α被干扰后的K562细胞对HHT的敏感性增加。结论:抑制K562细胞的HIF-1α表达可以抑制血管生成和糖代谢相关基因表达,并且增加对HHT的敏感性。

RNA干扰体外抑制人食管鳞癌细胞Eca-109缺氧诱导因子-1α的表达

目的:观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中 HIF-1α基因的沉默效应,筛选有效干扰靶点．方法:设计合成干扰缺氧诱导因子-1α RNA 寡核苷酸片段,经退火、连接等步骤克隆至线性化的PGCsi真核表达载体上,测序鉴定．应用LipofectamineTM2000将该质粒分别转染Eca-109细胞和293T细胞,其中Eca-109抗性细胞又经2-4 wk的G418筛选．荧光显微镜评估转染效率,荧光定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达情况,western blot检测HIF-1α蛋白表达情况．结果:成功构建了3个靶点的重组质粒pGCsi- H1-shHIF,293T细胞平均转染效率为约85．4％, Eca-109细胞的平均转染效率约73．2％．荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染这3种重组质粒的293T细胞和筛选2 wk的Eca-109 细胞HIF-1 α mRNA和蛋白表达均较对照组有不同程度的下降,其中2号和3号靶点的干扰效应尤为明显．在瞬时转染72 h后的293T 细胞中,其抑制率分别达到了78．5％、86．9％ (P=0．000,P=0．000 vs 72 h空白对照组),筛选2 wk的Eca-109细胞中,3号靶点对HIF-1α mRNA的抑制率也达到了69．7％(P=0．000 vs 2 wk空白对照组)．结论:重组质粒pGCsi-shHIF能有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因的表达,经不同细胞中的瞬时和稳定转染筛选出了有效干扰靶位．

干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的表达

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的抑制作用。方法:构建HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α。选择7d龄C57BL/6J小鼠24只,其中6只为正常组(A);另18只建立缺氧诱导的视网膜新生血管模型,并随机分为:对照组(B)、空载体组(C组)和基因治疗组(D组),每组6只。于出舱前1d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射pSUPER空载体质粒;基因治疗组注射HIF-1αsiRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α。采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态变化;SP免疫组织化学检测各组间HIF-1α的表达差异。结果:荧光造影视网膜铺片显示,A组整个视网膜血管分布呈均匀网状;B、C组视网膜中周部可见大片无灌注区,见新生血管丛,伴荧光渗漏;D组无灌注区较B,C组明显减少,周边部毛细血管网基本正常,新生血管丛明显减少。免疫组织化学染色显示,A组HIF-1α蛋白表达阴性;B,C组在神经节细胞层呈阳性表达;D组在神经节细胞层呈弱阳性表达,较B,C组明显减少。结论:采用玻璃体腔注射,通过脂质体介导HIF-1αsiR-NA重组质粒pSUPERsiHIF-1α转染视网膜,有效地抑制了缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1α蛋白质的表达及视网膜新生血管的形成。

短发夹RNA干扰胃癌低氧诱导因子-1α表达及其临床意义

目的探讨RNA干扰对胃癌细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录和蛋白表达的作用以及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建人HIF-1α基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并转染胃癌细胞BGC-823;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1αmRNA、蛋白表达水平;MTT法检测转染后对胃癌细胞生长的抑制;TUNEL法观察细胞的凋亡情况;流式细胞术分析转染后胃癌细胞的细胞周期和凋亡率。结果成功构建了pshRNA-HIF-1α1和pshRNA-HIF-1α2重组质粒;转染BGC-823后,与空质粒组相比,pshRNA-HIF-1α1可有效抑制BGC-823细胞HIF-1α基因转录和蛋白质表达,抑制率分别可达93.4%和55.7%;MTT法显示转染后细胞生长明显受到抑制;流式细胞术结果表明转染后,其凋亡率明显高于空质粒组(P<0.05),BGC-823细胞增殖活性显著降低,G0～G1期细胞比例明显增加,S期与G2～M期细胞比例减少;TUNEL法显示转染后细胞核固缩,核染色质聚集或断裂;体内实验显示,pshRNA-HIF-1α1的抑瘤率为41.75%。结论体内、外初步实验证实pshRNA-HIF-1α1能有效抑制胃癌细胞BGC-823 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖,诱导其凋亡。

特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响

目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期。结果菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确。并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因。细胞周期检测提示PTH1R沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期。结论成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用。

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞株TE13的生物学特性的影响

目的:探讨HIF-1α沉默后对食管癌细胞株TE13的生物学行为的影响.方法:应用倒置荧光显微镜观察HIF-1α的干扰质粒转染食管癌细胞TE13后绿色荧光蛋白的表达;采用Western blot方法检测HIF-1α蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞增殖能力的变化;Transwell方法检测干扰前后细胞迁移能力的变化;流式细胞术检测干扰前后细胞周期的变化.结果:TE13/12单克隆干扰效果好,Western blot结果显示无HIF-1α表达.HIF-1α被干扰后,细胞增殖能力明显减弱(P<0.05),运动迁移能力显著下降,与未转染的细胞相比穿过人工基底膜的细胞数明显减少(18.2±3.7vs103.8±8.5,P<0.05).与未转染组相比,TE13/12的细胞周期发生变化,G2/M期细胞明显减少(5.99%±1.19%vs20.47%±4.30%,P<0.05),S期增加(64.67%±1.98%vs48.53%±3.89%,P<0.05).结论:RNA干扰可引起TE13中HIF-1α的沉默,而HIF-1α表达下调后食管癌细胞株TE13的增殖与迁移能力均减弱.推测阻断HIF-1α通路有可能成为治疗人食管鳞癌的新靶点.