间充质干细胞体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化

研究间充质干细胞(MSC)能否在体外调控造血。体外分离培养人骨髓来源的MSC,RT-PCR检测其造血生长因子的表达,并以其为饲养层细胞,接种骨髓单个核细胞(MNC),观察生长情况,并通过形态学观察和流式细胞术分析,鉴定细胞来源和分化方向。结果显示,MSC构成性表达SCF、Flt3L和M-CSF,不表达G-CSF和GM-CSF,在骨髓MNC和MSC共培养体系中,大约2周左右可以看到大量的圆形细胞粘附在梭型MSC上生长,细胞胞体为圆形,胞浆较丰富,胞核为圆形、半月型或肾型,部分细胞呈典型的单核细胞形态,流式细胞术分析该类细胞表达CD14,不表达CD15、CD41、glycophorin A、CD5和CD19。表明不需要添加外源性造血生长因子,间充质干细胞能在体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化,其定向分化可能与MSC分泌造血生长因子及MSC与造血细胞间相互作用有关。

造血前体细胞凋亡与再生障碍性贫血

再生障碍性贫血 (AA)患者的骨髓造血功能衰竭 ,与其造血前体细胞 (CD34+ 细胞 )过度凋亡有关 ,AA患者的细胞免疫异常、体液免疫异常以及造血基质的异常 ,均可导致CD34+ 细胞过度凋亡 ,这可能是各种因素引起骨髓造血功能衰竭 。

胎肝造血前体细胞特征及其临床应用的研究进展

肝脏是胎儿时期的主要造血器官,鼠胚胎12～15 d[1,2]和人胚胎6周至4月是肝脏造血活跃期.在个体发育阶段上,胎肝造血干细胞(HSCs)较骨髓造血干细胞原始;从生理需求角度讲,骨髓HSCs的功能是维持终生造血稳定,其分裂采取群体不对称方式,因此骨髓HSCs数目在人体内保持恒定.而胎肝造血是处于由胚胎造血系统分化形成转向为胎儿日益扩张的循环容量和氧需提供足够红细胞的过渡时期,因此,胎肝HSCs有一个对称分裂以增加自身数目的性能和过程,以便为终生造血稳定提供足够的干细胞贮备[1,3,4].因此可以推测,胎肝造血前体细胞在增殖潜力、多系分化和自我更新能力方面应该比骨髓相应细胞更具优势.本文就近年有关胎肝造血前体细胞生物学特征及其临床应用方面的进展作一综述.

增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸调节脐血CD34^+造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应

目的:探讨低浓度增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸(PCNA-ASODN)调节脐血造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应。方法:用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离出CD34+细胞,先后加入低浓度PCNA-ASODN作用于体外培养的CD34+细胞,用流式细胞仪检测培养后各种细胞的数量及细胞周期的变化。结果:实验组脐血CD34+造血前体细胞明显被扩增,但以第72 h组的扩增效应最为显著,其CD34+细胞比例增高[(35.6±1.8)%],而CD34+CD38-细胞数量扩增达(55.1±4.2)倍,且G0/G1期细胞占(49.8±2.5)%。结论:低浓度PCNA-ASODN对脐血CD34+造血前体细胞体外扩增的调节具有时间效应,同时能延缓扩增过程中伴随的细胞分化。

rhIL-17对小鼠造血前体细胞和人脐血CD34^+干细胞分化发育的影响

目的:探讨重组人白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)对小鼠骨髓造血前体细胞和人脐血来源的CD34^+干细胞生长发育的影响.方法:采用常规方法采集小鼠造血前体细胞;采用Mini-MACS分离技术,从正常人脐血分离人CD34^+干细胞.体外加入IL-17和/或GM-CSF、IL-4培养分离的前体细胞,应用流式细胞仪检测其表型,采用ELISA法检测了其分泌的IL-12水平,通过[~3H]-TdR掺入法测定其刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力.结果:IL-17促进了小鼠骨髓来源的未成熟DC表达Ia,B7-2等免疫分子,促使其分泌较高水平的IL-12,该细胞也能刺激同种异体T细胞有效增殖,表现出了成熟DC的特征.IL-17单独培养9d促使人脐血CD34^+干细胞扩增了2倍,部分细胞高表达CD1a及B7-2,低表达HLA-DR,未检测到CD83的表达.该细胞能促使同种异体T细胞增殖,但作用较弱;而rhIL-17与GM-CSF联合培养后扩增了14倍,培养细胞中CD1a、B7-2阳性细胞的比例明显升高,且此细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力较强.结论:IL-17体外可促进小鼠骨髓造血前体细胞来源的DC成熟;与GM-CSF联合培养既能促进CD34^+干细胞增殖,又能使之获得DC特征,初步提示IL-17与GM-CSF联合作用可促进CD34^+干细胞向DC分化.

两种人胚胎干细胞体外诱导CD34^+造血前体细胞方法的比较

目的对比小鼠骨髓基质细胞系OP9共培养和二维单层诱导方法体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)产生CD34+造血前体细胞的效率,为后续研究提供参考。方法采用hESCs与OP9共培养方法或用二维单层诱导方法诱导hESCs产生CD34+造血前体细胞,通过流式细胞仪检测分化效率,比较两种方法的效果。结果通过hESCs/OP9共培养方法,hESCs在分化第9日出现CD34+细胞,比例达(19.7±7.9)%;通过二维单层诱导方法,hESCs在分化第6日即出现CD34+细胞,比例仅为(5.8±1.8)%,两种方法分化效率比较差异具统计学意义(P<0.05)。结论 hESCs/OP9共培养方法和二维单层诱导方法均可将hESCs诱导为造血前体细胞,相对于二维单层诱导方法,hESCs/OP9共培养方法尽管需要更长的时间,但其分化效率更高,更有利于后续研究。

骨髓造血前体细胞发育与粘附分子

造血前体细胞(hematopoietic progenitor cells,HPCS)在骨髓微环境内的发育是一个复杂过程。其间离不开HPCS与微环境内基质细胞、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、生长因子之间密切、协调的相互作用。业已证明,一组细胞膜表面的粘附分子(cytoadhesion molecules,CAM)在介导这些相互作用中起至关重要的作用。本文从参与HPCS发育过程中的CAM种类、作用、机制等方面,就近年国外研究进展作一综述。1 参与HPCS发育的CAM 参与HPCS发育的CAM多种多样。早期资料来源于对骨髓移植时造血干细胞“归巢”(homing)机制的探讨。研究表明,HPCS可通过膜表面凝集素(lectin)样分子与骨髓基质细胞膜上含甘露糖、半乳糖成份的糖化类结构特异性结合介导其归巢骨髓,而这种凝集素与选择素L密切相关。进而Lewinsohn等通过流式细胞分析发现人HPCS（包括CFU-GM。

成骨细胞促进胚胎干细胞向造血前体细胞分化的研究

目的 观察成骨细胞对胚胎干细胞（ESC）向造血前体细胞分化的促进作用.方法 用平皿黏附法培养BALB/c小鼠骨髓基质细胞,诱导分化为成骨细胞,鉴定后用作支持细胞.将小鼠胚胎于细胞（ESC-D3）先诱导生成胚胎体（EB）,再与成骨细胞共培养,3d后进行代表血液血管干细胞的原始细胞集落（BL-CFC）培养并计数;7d后行流式细胞仪检测ESC来源的CD34＋细胞生成比例.结果 在成骨细胞的支持下,与空白对照比较,ESC来源的代表血液血管干细胞的BL-CFC集落增加了2.89倍;由ESC生成的CD34＋细胞由（12.68±2.39）％增加到（32.83±3.84）％.结论 成骨细胞体外可促进胚胎干细胞向造血前体细胞分化.

C57BL/6小鼠来源的胚胎干细胞建系及体外定向造血分化的研究

哺乳动物的胚胎造血表现为时间和空间的连续变化。既往研究表明 ,12 9小鼠来源的胚胎干细胞系(embryonicstemcells,ES细胞 )的体外分化能在一定程度上模拟胚胎造血。为研究C5 7BL 6小鼠来源的ES细胞系体外定向造血细胞分化的特点 ,分离C5 7BL 6小鼠 3.5天囊胚的内细胞团建立ES细胞系并采用常规方法鉴定 ,应用体外二步分化法形成拟胚体并进行集落培养 ,细胞化学染色和RT PCR鉴定造血前体细胞。结果表明 :所建ES细胞系MES 1符合建系标准 ,其体外分化后可在不同阶段的拟胚体中发现多种造血前体细胞的有序出现 ,包括原始红系前体细胞 ,永久红系前体细胞 ,混合集落形成细胞和粒单系集落形成细胞。RT PCR分析显示 ,拟胚体表达多种造血特异性的转录因子和造血标记。结论 :自C5 7BL 6小鼠建立的ES细胞系MES

白细胞介素-15对骨髓增生异常综合征骨髓造血干/祖细胞增殖的影响

目的 :观察白细胞介素 (IL 15 )对体外培养的骨髓增生异常综合征 (MDS)患者CD34+ 细胞增殖作用。方法 :应用单克隆抗体免疫磁珠分离系统提取MDS患者CD34+ 细胞 ,以加IL 15组为实验组 ,不加IL 15组为对照组 ,进行液体和甲基纤维素半固体集落培养 ,计算培养后细胞数和CFU E、BFU E、CFU GM、CFU GEMM等集落数 ,并用MTT比色法检测IL 15对MDS患者CD34+ 细胞增殖的抑制作用 ,流式细胞术检测上述培养细胞周期的变异情况。结果 :11例MDS对象平均CD34+ 细胞比例、回收率、纯度和富集倍数均达要求 ,MTT比色法检测IL 15对CD34+ 细胞的增殖作用呈最佳浓度效应 ,最佳浓度为 2 0 μg/L ,细胞增殖抑制最低峰值时间为 8d。用 0 μg/LIL 15 (对照组 )和 2 0 μg/LIL 15 (实验组 )作用MDSCD34+ 细胞 ,计数显示培养细胞最大增殖倍数和集落形成比率实验组均较对照组明显增加 ,IL 15作用后各细胞周期G1、S、G2 期比例有明显改变 ,与对照组比较 ,差异有统计学意义。结论 :IL 15对MDSCD34+ 细胞有促增殖效应 ,与其它造血生长因子具有协同作用 ,对MDS治疗可能有一定的应用前景。

朗格罕斯细胞组织细胞增生症的造血干细胞移植治疗

朗格罕斯细胞组织细胞增生症（Langerhans cell histiocytosis,LCH）是一种发病机制尚未完全明了的组织细胞病。正是因为发病机制未完全阐明,长期以来对LCH的治疗均基于经验的积累。尽管治疗的根本措施改进甚少,但由于支持治疗的进步,最初6周诱导未获得良好治疗反应的患者均重复进行诱导治疗。

小鼠胚胎AGM区Flk-1^+细胞的造血特性

本研究旨在考察Flk-1分子在胚胎期10.5 d(E10.5)的主动脉-性腺-中肾区(AGM区)不同类型造血前体细胞的表达情况。通过流式细胞术分析发现低于10%的Flk-1+细胞与CD41、CD45/Ter119有共表达,继而分选出CD31+CD45-Ter119-Flk-1+CD41+(R1,代表不成熟的造血前体细胞)和CD31+CD45-Ter119-Flk-1+CD41-(R2,代表内皮细胞)两群细胞,利用造血集落培养和OP9共培养体系分别考察其体外的髓系与淋系潜能。结果表明:仅R1组细胞能在造血集落培养体系中形成典型的造血集落,但与OP9共培养7-9 d后,两组细胞均能产生丰富的造血前体细胞(CD45+c-Kit+)、髓系细胞(Gr-1+/Mac-1+)、红细胞(Ter119+)和B淋巴细胞(CD19+)。结论:E10.5的小鼠胚胎AGM区Flk-1仍然在幼稚的造血前体细胞以及更早期的生血内皮细胞表达,但是此时的造血干细胞前体和造血干细胞是否表达Flk-1仍需通过体内功能实验明确。

造血与白血病细胞增殖的体液因子调节

造血前体细胞的增殖与分化由一系列正性/负性遣血因子瀑布(CasCade)多步调节。活化癌基因编码的、异质性造血因子和/或其特异性受体与白血病细胞增殖相关,并提出造血系统肿瘤细胞存在自分泌与非自分泌两种以上不同的生长方式。对造血系统肿瘤病变机制新的认识可提供新的策略,以改善治疗前景。

从人胚胎干细胞获得造血集落形成细胞

人类胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)是未分化的多潜能细胞,能在体外培养基中无限增殖。本文用体外研究证实当与小鼠骨髓基质细胞系S17或卵黄囊内皮细胞系C166共培养时,人ES细胞能分化为造血前体细胞。这种造血分化需要胎牛血清,而不需其他外源的细胞因子。

IL-15联合其他细胞因子对MDS患者CD34^+细胞体外增殖、分化的影响

为了探讨IL 1 5与其他细胞因子联合应用对体外培养的MDS患者CD34+ 细胞增殖和分化的影响。应用单克隆抗体(mAb )免疫磁珠系统分离CD34+ 细胞 ,实验分为IL 1 5加其他细胞因子的实验组和不加其他细胞因子的单独应用IL 1 5的对照组 ,用液体培养基和甲基纤维素半固体培养基培养 ,计数培养后细胞数和CFU E、BFU E、CFU GM、CFU GEMM的集落形成数。用流式细胞术检测上述培养细胞上各种表型分子CD33、CD1 3、CD71、CD1 9、CD3表达的变化和细胞周期的改变。结果显示IL 1 5与其他细胞因子联合应用的实验组作用于MDS患者CD34+ 细胞 ,培养 6d的细胞计数显示 ,细胞增殖倍数对照组为 4 0倍 ,实验组为 7 8倍 ;各祖细胞集落形成率实验组均明显多于对照组 ;培养细胞上各表型分子 (CD3除外 )的表达率实验组均明显高于对照组 ;IL 1 5加其他细胞因子联合应用后CD34+ 细胞的细胞周期G1 、S、G2 期的比率均有明显变化 ,与对照组相比较 ,差异显著。IL 1 5与其他细胞因子联合应用比单独应用IL 1 5对MDS患者CD34+ 细胞有明显地促增殖和诱导分化的效应。