造血发育和内皮细胞的关系

研究造血和血管内皮在胚胎发育中的关系,包含对造血细胞和内皮细胞的发育起源以及相关分子调控的探讨。以已有的研究结果为基础,对造血细胞和血管内皮细胞发育关系提出了成血血管细胞(hemangioblast)和生血内皮(hemogenic endothelium)的两种模式。在卵黄囊和P-Sp/AGM区,造血和内皮细胞的发育关系分别表现出不同的特点:二者在卵黄囊共同来源于成血血管细胞;在AGM区则更多表现为生血内皮的模式。造血和血管内皮相关分子的表达和调控作用的研究,不仅体现了造血和内皮在发育中的密切关系,同时也加深了对造血发育调控的认识。本文就原始造血和永久造血的发育、造血和血管内皮发育相关的两种模式及造血和内皮发育相关分子问题进行了综述。

按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究

为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞(HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+FL组,③AGM+FL+BM组,④照射对照组,⑤正常对照组。观察各组生存率、造血重建和植入状况。结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)%;NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成;AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8%、66.7%,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因。结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血。

TGF-β信号在造血发育中的作用

造血发育包括胚胎期的造血发生和成体造血稳态的维持。作为重要模式生物的小鼠为研究造血发育提供了非常好的模型。转化生长因子-β(TGF-β)作为造血调控的重要因子受到越来越多的重视。系统地研究TGF-β信号在哺乳动物个体发育的生理环境下对造血发生和发育的作用,随着基因剔除技术的建立和成熟而成为可能。本文就近年来以小鼠为研究对象,应用基因剔除、显性负效转基因等手段构建的TGF-β信号分子缺失个体的造血相关表型等研究作一综述,以进一步阐明TGF-β信号在造血发生和发育中的作用及可能机制。

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系。方法选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼)。通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18 h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义m RNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位。结果 q RT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P<0.05);制备了rap1b基因的反义m RNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18~48hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达。结论在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程。

Notch4信号在小鼠胚胎早期造血发育的表达

目的:探讨小鼠胚胎发育过程早期造血组织中Notch4信号的基因与蛋白的表达情况。方法:采用PT-PCR和Western blot方法,对小鼠胚胎孕9.5 d(E9.5)、E10.5、E11.5、E12.5胚胎的主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)区和胎肝中Notch4信号基因和蛋白的表达进行检测。结果:2组小鼠早期造血相关组织的Notch4 mRNA与蛋白表达,在AGM区E10.5组较其它组明显增高(P<0.05);在AGM区和胚胎中都是随着孕龄的增大而逐渐减低(P<0.01)。AGM区与胚胎中比较,在9.5 d和12.5 d有统计学意义(P<0.05);在10.5 d与11.5 d无统计学意义(P>0.05)。PT-PCR结果显示表达规律相同。结论:Notch4信号在小鼠胚胎早期造血组织中有表达,但其功能有待进一步研究。

RNA结合蛋白Rbm38在小鼠胚胎造血发育中的功能研究

目的:探究RNA结合蛋白Rbm38在小鼠造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)发育中的作用。方法:分析造血干细胞发育过程中连续群体的单细胞转录组数据,筛选生血内皮细胞(hemogenic endothelial cell,HEC)和/或造血干细胞前体(hematopoietic stem cell precursor,pre-HSC)阶段表达上调的RNA结合蛋白分子(RNA binding protein,RBP);利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除小鼠模型,将杂合型小鼠交配获得实验用胚胎,按照小鼠胚胎基因型不同将实验分为实验组和对照组,实验组为Rbm38^(-/-)基因型胚胎,对照组为Rbm38^(+/+)和Rbm38^(+/-)基因型胚胎;取材胚胎期11.5 d(embryonic day 11.5,E11.5)孕鼠胚胎的卵黄囊(yolk sac,YS),行体外造血细胞集落形成实验(colony forming unit-culture,CFU-C)检测主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区和卵黄囊生成造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)的能力,行小鼠胚胎AGM区移植实验评价AGM区产生功能性造血干细胞的能力。结果:(1)Rbm38在动脉内皮细胞(arterial endothelial cell,AEC)向生血内皮细胞和Ⅰ型造血干细胞前体(type 1 pre-hematopoietic stem cell,T1 pre-HSC)的转化过程中表达明显上调,且在后续造血干细胞成熟的过程中维持高水平表达;(2)实验组和对照组E11.5小鼠胚胎AGM区和卵黄囊生成造血祖细胞数量以及其分化功能无统计学差异(P>0.05);(3)实验组和对照组移植后外周血嵌合率无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)多种RNA结合蛋白分子,如Rbm38,在小鼠生血内皮细胞与Ⅰ型造血干细胞前体阶段特异性高表达;(2)敲除Rbm38不影响小鼠胚胎AGM区和卵黄囊生成造血祖细胞的能力;(3)敲除Rbm38不影响小鼠胚胎AGM区产生功能性的造血干细胞。

造血发育过程中造血祖细胞生物学特性的时空变化

本实验以小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区、胎肝(fetalliver,FL)以及小鼠骨髓(bonemarrow,BM)为研究对象,研究各阶段造血祖细胞在发育过程中的c-kit的表达变化和部位迁移,以及不同发育阶段、不同造血部位来源c-kit+细胞的生物学特性。用流式细胞术检测小鼠胚胎10.5天(embryonic10.5,E10.5)、E11.5的AGM区,E12.5、E14.5、E16.5、E18的FL以及BM来源的单个核细胞中c-kit+细胞的比例。用磁珠分选法分离E10.5AGM区、E14.5FL以及BM来源c-kit+细胞,贴壁培养法分离小鼠E14.5FL基质细胞。建立体外Transwell共培养体系,比较不同来源的c-kit+细胞增殖、分化、迁移以及集落形成能力。流式细胞术检测发现:相对于BM,E10.5AGM区和E12.5FL中c-kit+细胞比例较高。进行体外培养,AGM区来源c-kit+细胞具有较强的增殖潜能,而FL、BM来源的c-kit+细胞在体外培养中更容易分化;AGM区和FL来源的c-kit+细胞比BM来源的c-kit+细胞在体外培养中具有更强的趋化迁移能力。集落形成能力方面,AGM区来源c-kit+细胞具有较强形成混合集落形成单位(CFU-Mix)的能力;FL、BM来源c-kit+细胞则能形成更多粒单系集落形成单位(CFU-GM)。以上结果表明,和FL、BM来源的c-kit+细胞相比,AGM区来源c-kit+细胞具有更强的体外增殖、多系分化潜能以及趋化迁移能力,在未来可能有着更广阔的应用前景。

miR-150在造血发育中的功能研究

miR-150是一个在哺乳动物中表达的含22个核苷酸的miRNA,能通过抑制靶基因的翻译来调控细胞增殖、分化和凋亡等重要的生理、病理过程。miR-150的表达水平在造血发育不同谱系和不同阶段都存在明显差异,而造血发育异常也同样伴随着miR-150的表达异常,提示miR-150能够调控机体造血发育过程,参与了造血发育异常的发生。在机体造血系统中,miR-150主要通过调控其靶基因的表达来影响造血发育过程以及各谱系细胞的成熟、活化与功能效应。目前已报道的miR-150靶分子主要有c-Myb、Notch3、GAB1、FOXP1、Cxcr4、Prf1等。现就近年来miR-150在造血发育过程中的研究作一综述。

Ikaros家族成员在造血系统发育过程中的作用与意义

造血细胞在发育过程中受许多转录因子调控,其中Ikaros家族是这些转录因子的重要代表之一。Ikaros转录因子具有特征性的保守结构模序,能够与含关键基因启动子或增强子的DNA特异性短序列结合,调控它们的转录活性。同时,Ikaros转录因子还和其它的相关转录调节子之间相互作用,共同调控造血细胞的发育和分化。从结构上观察Ikaros家族,它们属于锌指结构转录因子,包括Ikaros、Helios、Aiolos、Eos和Pegasus 5个成员,分别由IKZF-1、2、3、4、5基因编码。它们是造血作用的主要调节子,通过单独或共同调控发挥作用,特别对淋巴细胞等造血细胞的发生、发展以及功能的正常发挥中具有重要作用,家族成员功能异常时常与疾病的发生、发展相关。本文综述Ikaros家族近年来取得的研究成果,一方面有助于深入理解这个家族在造血系统中的作用及意义,另一方面也为进一步开展研究工作提供可能的研究方向。

RNA修饰调控造血发育和白血病发生的研究进展

胚胎造血发育和成体造血稳态维持是复杂有序、高度保守的过程,受到诸多因素,包括细胞内转录因子、信号通路及表观遗传修饰和细胞外造血微环境的精密调控. RNA修饰将表观修饰从转录水平提升到转录后精确调控的新层面,参与调控多项重要生命过程,其在血液发育及白血病发生中的调控作用已有多项研究.本文系统总结了RNA修饰在胚胎造血发育、稳态维持及白血病发生中的功能和分子机制,不仅有助于完善目前对造血系统发育以及正常造血和恶性转化的认识,而且为寻找潜在的白血病治疗靶点提供了新思路.

胚胎造血细胞发育及其调控的研究进展

本文综述了胚胎不同位点造血细胞的发育特点,造血微环境对其发育的影响以及发育过程中相关基因表达与调控的研究进展。

下调rpl15基因的表达抑制斑马鱼早期造血的发育

目的探究核糖体蛋白L15(ribosomal protein l15,rpl15)基因表达下调对斑马鱼早期造血发育的影响。方法设计并合成rpl15吗啉代反义寡核苷酸(morphilino antisense oligo,MO),通过显微注射到单细胞期斑马鱼(0~0.75 hpf)的受精卵中来下调rpl15的表达,通过qRT-PCR和Western blot技术验证下调rpl15基因表达的有效性。使用体式显微镜分别观察注射rpl15 MO(MO)组与野生型(WT)组的发育情况。O-dianisidine染色检测血红蛋白表达的情况,qRT-PCR检测红系特异性转录因子hbae3、hbbe1的表达变化。全胚原位杂交和qRT-PCR检测红系特异性转录因子gata1、髓系转录因子pu.1、粒系转录因子mpo、定向造血标志转录因子runx1和c-myb、原始祖细胞造血标志物scl和lmo2等早期造血发育过程的关键转录因子的表达变化。TUNEL实验检测造血组细胞的凋亡变化。结果显微注射rpl15 MO能显著下调斑马鱼rpl15的表达,与WT组相比,MO组表现出体节弯曲、发育迟缓、心包水肿等异常表型。MO组血红蛋白合成量与hbae3、hbbe1的表达量相较于WT组明显减少(P<0.05)。原位杂交及qRT-PCR结果表明,gata1的表达明显减少(P<0.05),pu.1、mpo、runx1、c-myb的表达无明显变化,scl的表达明显减少(P<0.01),lmo2的表达无明显变化。TUNEL实验显示造血祖细胞的凋亡无明显变化。结论下调rpl15的表达抑制了斑马鱼早期的造血发育,并可能与gata1和scl表达明显降低有关。

陆军军医大学第二附属医院:朱波教授团队提出肿瘤背景下的新造血发育模式

6月14日, 肿瘤领域杂志Cancer Cell以封面文章形式发表陆军军医大学第二附属医院肿瘤科朱波教授团队题为"肿瘤诱导的红系来源髓系细胞介导免疫抑制及限制抗程序性死亡受体1(PD-1)/程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体治疗疗效"的最新研究成果。

RNA结合蛋白Mbnl1调控小鼠胚胎造血干细胞发育功能的研究

目的:分析小鼠胚胎造血干细胞(HSC)发育全程的单细胞RNA结合蛋白(RBPs)动态分子表达特征,筛选获得功能研究靶标RNA剪接因子——Mbnl1,并阐明Mbnl1参与调控小鼠胚胎HSC发育的功能。方法:生物信息学深入分析小鼠胚胎HSC发育全程的单细胞转录组数据,获得HSC发育全程的单细胞RBP动态分子表达图谱。结合差异分析以及文献调研筛选获得Mbnl1。利用CRISPER/Cas9技术构建Mbnl1基因敲除小鼠模型,采用甲基纤维素半固体培养体系,针对E11.5的Mbnl1^(+/+)和Mbnl1^(-/-)两种基因型小鼠胚胎的主动脉-性腺-中肾区(AGM)以及卵黄囊(YS)组织进行体外造血集落培养实验,7 d后统计造血集落的数量和类型;进一步通过尾静脉分别移植E11.5的Mbnl1^(+/+)和Mbnl1^(-/-)供体小鼠的整个AGM组织细胞,并通过检测受体小鼠4、8周的外周血移植嵌合率,依据小鼠造血系统重建的动力学实验来评价Mbnl1基因敲除后,AGM区HSC的功能是否受到影响。结果:体外造血集落培养实验结果初步提示,E11.5时Mbnl1^(+/+)和Mbnl1^(-/-)两种基因型小鼠胚胎AGM区和YS的造血集落数量并无显著差异,表明Mbnl1基因敲除后,AGM和YS组织中的造血祖细胞功能并未发生异常;Mbnl1^(+/+)及Mbnl1^(-/-)小鼠胚胎AGM区细胞的尾静脉移植实验结果显示,两者造血重建嵌合率并无显著差异,提示Mbnl1基因敲除后AGM组织中的HSC功能并未发生异常。结论:体内外的功能实验证实Mbnl1敲除后并不影响小鼠胚胎AGM区造血干祖细胞的发育。

利用谱系示踪研究小鼠胚胎发育早期的Flk1^+细胞

目的:了解中胚层来源的Flk1^+细胞在小鼠胚胎发育早期不同部位的分化情况,进而探索Flk1^+细胞是否在血管发育过程中有分化为周细胞等间质谱系的潜能。方法:基于Cre-LoxP系统的条件型基因敲除研究策略,利用Flk1-Cre小鼠和ROSA26报告小鼠进行谱系示踪研究。用GFP^+群体示踪Flk1^+细胞群体的命运。结合中胚层标志Flk1,造血细胞特异性标志CD45,内皮细胞特异性标志CD31、CD144以及Emcn(endomucin),周细胞特异性标志PDGFRβ和NG2,利用免疫组织化学、免疫荧光等组织检测和流式细胞术探究所关注的问题。结果:对谱系示踪小鼠Flk1-Cre;ROSA26-EYFP在胚胎发育早期不同部位的免疫组化结果显示,在背主动脉、肢芽及卵黄囊等多处造血位点周围Flk1^+细胞来源的GFP^+群体中,观察到除了造血细胞、沿血管壁特异性分布的CD31^+/Emcn^+典型内皮细胞外,还有间质样细胞等多种类型的群体。组织学研究显示这群表达在血管周围的既非造血又非内皮的细胞是周细胞。流式细胞术分析也证实,Flk1^+细胞贡献了周细胞。此外,在如背主动脉、肢芽等部位造血位点周围的GFP^+群体中还观察到小部分形态为间质样的CD31^+CD140B^+细胞群体。结论:在胚胎发育早期,中胚层来源的Flk1^+群体不仅贡献了造血、内皮、以及肌肉等谱系,还贡献了包括周细胞在内的间质谱系。推测观察到的CD31^+CD140B^+细胞群体可能是由Flk1^+祖细胞分化而来的内皮细胞,正经历着内皮间质转化EndMT,逐渐丢失内皮表面特异性标志,同时也开始表达周细胞表面标志。

人体胚胎骨髓组织细胞学的发育观察与研究

目的观察人体胚胎骨髓造血组织细胞的发生、发展规律，微环境的变化，以及对白血病诊断的意义。方法对９３例１～１０个月胚胎骨髓组织进行塑料包埋、半薄切片、Ｈ－Ｇ－Ｅ及组化染色观察。结果胚１月卵黄囊与羊膜囊周出现有核红细胞造血岛。胚２月软骨母细胞首先进入髓腔，骨髓微环境形成。胎３月骨髓出现各系各阶段造血细胞，胎儿期骨髓红粒比值始终倒置，以幼稚期血细胞为主，红粒系幼稚细胞成簇状聚集排列。胎５月骨髓出现脂肪，骨髓间质网纤与纤维细胞量少，中性粘蛋白为主。结论胚胎骨髓造血最早始于胚外中胚层的间充质细胞。胎３个月开始骨髓造血。软骨母细胞可能是髓内造血组织各种细胞的共同祖先，造血祖细胞是多源性的。胚胎期骨髓象类似髓性白血病。胎５月出现黄髓。组织结构变化比细胞形态变化对白血病的诊断更有指导意义。ＭＤＳ的诊断以髓索中央出现ＡＬＩＰ更确诊。

VentX促进人类造血干细胞向红系分化

GATA-2作为GATA家族成员,其通过与靶基因的GATA结合位点结合,在造血系统发育中起关键性的调节作用。VentX是非洲爪蟾蜍xvent基因同源的哺乳动物基因,最近研究发现,其参与了中胚层的分化定型及造血干细胞的维持,并且在细胞衰老、增殖、分化及炎症反应等的调节中发挥功能。为探索VentX基因与GATA-2的关系及其对造血干细胞红系分化的调节功能,首先在K562细胞株中进行了VentX启动子分析,发现GATA-2可以通过结合到VentX启动子区两个GATA结合位点来顺式调控Vent X;继而在人骨髓(造血)干细胞中的实验显示,过表达GATA-2或过表达VentX,均可抑制CD34^+细胞的增殖,促进CD34^+细胞向红系分化。以上实验结果为临床红细胞来源提供了有价值的研究线索。

AGM区基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化的实验研究

目的探讨主动脉-性腺-中肾(AGM)区来源的基质细胞诱导胚胎干细胞(ESC)向成血-血管干细胞分化的促进作用。方法从孕11 d的小鼠胚胎AGM区分离、培养基质细胞,鉴定后用作支持细胞,与小鼠胚胎干细胞共同培养,通过原始细胞集落(BL-CFC)的形成情况及流式细胞仪检测CD34+/Flt-1+细胞比例,评价AGM区基质细胞对小鼠ESC-D3细胞系向成血-血管干细胞的定向诱导作用。结果在AGM区基质细胞的支持下,由ESC来源的CD34+细胞由(12.71±1.76)%增加到(39.71±3.76)%,并且CD34+/Flt-1+细胞比例明显提高,达到(26.59±1.77)%;同时由ESC来源的代表成血-血管干细胞的BL-CFC集落增加了3倍。结论AGM区基质细胞可促进胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化,探明其机制对研究造血及血管发育机制有积极意义。

SOCS-3过表达对红系基因表达的影响

目的:建立能稳定、高效表达细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS-3)的细胞株SOCS-3-K562,为探讨SOCS-3在造血发育中的作用奠定基础。方法:通过重组慢病毒系统感染人红白血病细胞K562,采用流式细胞分选术,根据绿色荧光蛋白表达情况,获得稳定高表达SOCS-3的K562细胞;利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验,比较分选获得的细胞与对照细胞的SOCS-3表达差异;利用半定量PCR检测SOCS-3表达升高对K562红系发育相关基因GATA-1、β-globin表达水平的影响。结果:构建了人SOCS-3慢病毒表达载体;与对照组相比,通过流式细胞分选获得的K562细胞的SOCS-3基因表达水平升高8.05倍,蛋白表达水平升高3倍;SOCS-3表达升高后,K562细胞的GATA-1、β-globin基因表达受到明显抑制。结论:SOCS-3在造血发育中有重要的调控作用,而对其表达进行改变将在规模化的造血细胞定向诱导研究中发挥重要作用。

花斑裸鲤胚胎/仔鱼型血红蛋白基因家族成员鉴定与时序表达研究

为了探讨花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)血红蛋白时序转换利用花斑裸鲤全基因组数据鉴定胚胎/仔鱼型血红蛋白基因家族成员,并通过整胚原位杂交方法,检测花斑裸鲤胚胎/仔鱼型血红蛋白基因在胚胎发育不同阶段的表达及定位。结果表明,花斑裸鲤基因组中共鉴定到5个胚胎/仔鱼型血红蛋白基因,分别为hbae1、hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3,与斑马鱼(Danio rerio)相比,花斑裸鲤基因组缺少hbae3和hbbe2基因,暗示第四轮全基因组复制事件后所经历的小规模基因删除事件在花斑裸鲤特异性血红蛋白基因形成中发挥了重要作用。整胚原位杂交结果显示,hbae1基因在胚胎发育的120h至432h内持续表达,hbbe1基因在96h开始表达持续至432h,hbbe3基因杂交信号出现在胚胎发育120h至384h内,在胚胎发育全过程中未能观察到hbae4和hbae5基因的杂交信号。杂交信号主要位于胚胎正中轴、后部侧向中胚层、背主动脉腹侧区、尾部造血区及卵黄。正义探针作为阴性对照,在胚胎发育阶段均无任何杂交信号。花斑裸鲤具有与其他鱼类不同的胚胎/仔鱼型血红蛋白基因家族成员及血红蛋白转换表达特征;hbae1、hbbe1和hbbe3基因在花斑裸鲤早期胚胎发育过程中发挥重要作用,而hbae4和hbae5基因的生物学功能可能有所弱化。