肝癌组织中遗传印记基因PEG10表达的特异性及其意义

目的:研究PEG10在肝癌组织中表达的特异性,为其作为一个潜在的肝癌基因治疗的新的分子靶点提供实验依据.方法:从来自不同器官组织的肿瘤细胞系(人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞株SGC7901、人结肠癌细胞株Lovo、人胰腺癌细胞株PC3、人黑色素瘤细胞株A375、人T淋巴瘤细胞株Jurkat)、正常人胎肝细胞株L02、32例肝癌患者的肝癌组织、癌旁组织、10例良性肝病患者肝组织、10例正常人外周血单个核细胞中抽提总RNA,经RT逆转录合成cDNA,再以PCR方法检测PEG10的表达.同时,肝癌组织和癌旁组织标本经RT-PCR检测AFP的表达.结果:经RT-PCR扩增的PEG10基因片段为455bp,AFP基因的扩增片段为140bp,与原设计一致;PEG10在人肝癌细胞株HepG2中明显表达,人胃癌细胞株SGK7901、人结肠癌细胞株Lovo、人胰腺癌细胞株PC3中弱表达,而正常人胚胎肝细胞株LO2和其他肿瘤细胞株(人T淋巴细胞瘤、人黑色素瘤)中表达均为阴性雇32例肝癌及相应癌旁组织中,PEG10的表达阳性率分别为78.1%和0%;而AFP基因的阳性率分别为93.8%和59.4%.经McNemar检验,显示PEG10基因在肝癌组织中表达的敏感性与AFP表达敏感性之间无显著性差异(X20.01,1=1.78,P>0.05);而癌旁组织中PEG10表达率(0/32)明显低于AFP表达率(19/32)(X20.01,1=17.05,P<0.01).另外10例良性肝病患者(肝硬化4例,自身免疫性肝病2例,肝血管瘤2例,丙型肝炎1例,血色素病1例)肝组织标本及正常人的外周血细胞进行PEG10基因检测,结果均为阴性.结论:PEG10的表达不但具有比AFP更高的肝癌组织特异性,而且具有相对器官组织特异性.本实验为PEG10作为一个新的肝癌标志物和基因治疗的分子靶点提供了实验依据.

靶向遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体。方法根据PEG10基因cDNA序列,设计针对目的基因的4个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论本研究成功构建针对PEG10的真核表达载体,可能成为肝癌基因治疗中的一种新型、高效的治疗载体。

肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10转基因载体的构建和鉴定

目的构建小鼠肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10的转基因载体pALB-PEG10-EGFP,为制备转基因小鼠做准备。方法RT-PCR扩增PEG10基因cDNA序列,克隆入T载体进行酶切、测序鉴定,后将其定向克隆至真核表达载体pALB-EGFP中ALB的下游,构建转基因载体pALB-PEG10-EGFP;在Lipofectamine介导下转染L02细胞,经G418抗性筛选,挑选阳性克隆并扩大培养;采用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法分析PEG10在L02细胞中的表达和细胞内定位。结果酶切和测序结果表明pALB-PEG10-EGFP构建成功;稳定转染后的L02表达有PEG10的mRNA及蛋白,且主要定位于胞浆。结论重组体pALB-PEG10-EGFP的构建初步奠定了转基因小鼠制备的基础。

长链非编码RNA父系表达遗传印记基因10靶向微小RNA-34a对口腔鳞状细胞癌生物学功能的影响

目的探讨长链非编码RNA父系表达遗传印记基因10(lncRNA PEG10)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达,以及通过调节微小RNA(miR)-34a对OSCC细胞增殖和迁移的影响。方法收集53例口腔鳞癌组织和癌旁组织作为研究对象,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)分析组织中lncRNA PEG10和miR-34a的表达水平。口腔鳞癌SCC-25细胞采用随机数表法分为si-NC组、si-lncRNA EG10组、miR-34a mimics组、miRNA-NC组。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、细胞划痕实验和Transwell实验检测各组细胞增殖和迁移能力;双荧光素酶实验报告基因实验验证lncRNA PEG10与miR-34a的靶向关系。计量数据组间比较采用独立样本t检验,计数数据采用皮尔森卡方检验。结果lncRNA PEG10在OSCC肿瘤组织中的平均表达量(2.452±0.750)高于癌旁组织(1.293±0.326),差异有统计学意义(t=8.365,P<0.05)。lncRNA PEG10组细胞lncRNA PEG10表达水平(2.868±0.115)高于lncRNA对照组(0.973±0.003),差异有统计学意义(t=11.99,P<0.01)。miR-34a mimics组细胞miR-34a表达水平(1.310±0.010)高于miRNA对照组(0.251±0.020),差异有统计学意义(t=34.16,P<0.01)。lncRNA PEG10的高表达与淋巴结转移(χ^(2)=5.577,P<0.05)和临床分期(χ^(2)=6.606,P<0.05)相关。lncRNA PEG10沉默后,SCC-25细胞的增殖能力在48 h(0.416±0.009)和72 h(0.555±0.048)的检测点A值明显低于对照组(0.561±0.037和0.894±0.025,F_(48 h)=590.1,F_(72 h)=105.8,P<0.05)。lncRNA PEG10敲减组细胞划痕愈合率[(157.000±18.457)%]明显低于lncRNA对照组[(74.000±14.256)%],差异有统计学意义(t=19.452,P<0.05)。结论lncRNA PEG10在口腔鳞癌中表达上调,而miR-34a表达水平下调,lncRNA PEG10通过靶向结合miR-34a调节口腔鳞癌细胞增殖和迁移。

MiR-122调控肝癌遗传印记基因PEG10的实验研究

目的探讨遗传印记基因PEG10功能的异常与miRNA失调控的相关性。方法通过生物信息学网站TargetScan预测可能参与PEG10调控的miRNA分子，筛选到miR～122。通过基于taqman探针的实时定量逆转录聚合酶链反应，比较miR-122在原代正常肝细胞和3株肝癌细胞株（Huh7，Hep3B，HepG2）中的表达差异。将miR-122的分子前体转染HepG2细胞，观察转染前后PEG10在mRNA和蛋白水平的表达变化。多组均数间比较采用秩和检验，配对样本组间差异比较采用t检验。结果生物信息学预测结果显示，miR-122可能参与了PEG10的调控。实时定量逆转录聚合酶链反应结果显示，PHHC，Huh7、HepG2、Hep3B细胞miR-122的表达量（2^△ △ Ct值）分别为1．0578±0．0975、0．5600±0．0632、0．0068±0．0012、0．0058±0．0008，H=9．667，P〈0．05。与原代正常肝细胞相比，miR-122在肝癌细胞株中表现为完全（Hep3B、HepG2细胞）或部分缺失（Huh7细胞），其表达水平与PEG10呈负相关。将miR-122分子前体转入HepG2细胞后，PEG10在mRNA水平并未显示出明显的下调，但Western blot结果提示miR-122分子前体明显抑制了PEG10蛋白的表达。结论miR-122参与了遗传印记基因PEG10的调控，其调控主要发生在翻译阶段，即蛋白质水平。miRNA的失调控与肝癌的发生密切相关，其功能的异常可能早于受其调控的癌基因或抑癌基因的改变，是肝癌发生的早期事件，这为肝癌的早期预警和基因治疗提供了新思路。

子宫内膜癌组织中IGF2BP1mRNA,PEG10mRNA表达及与增殖基因表达的相关性和预后研究

目的研究子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)组织中胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(insulinlike growth factor 2 mRNA binding protein 1,IGF2BP1)mRNA,父系表达遗传印记基因10(patrilineal expression of genetic imprinting gene 10,PEG10)mRNA表达及与增殖基因表达的相关性及预后。方法选取2017年1月~2019年1月湖北理工学院附属妇幼保健院诊治的100例EC患者。实时荧光定量PCR检测EC癌组织和癌旁组织中IGF2BP1 mRNA,PEG10 mRNA及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)mRNA,细胞周期素D1(cyclin D1)mRNA,细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)mRNA表达。免疫组织化学检测IGF2BP1,PEG10蛋白表达。相关性采用Pearson相关分析。Kaplan-Meier曲线分析不同IGF2BP1,PEG10表达组EC患者的预后差异。COX回归分析EC患者的预后影响因素。结果EC癌组织中IGF2BP1 mRNA(1.84±0.33),PEG10 mRNA(2.12±0.40),PCNA mRNA(3.14±0.42),cyclinD1 mRNA(2.81±0.36),CDK4 mRNA(2.37±0.34)高于癌旁组织(0.78±0.21,0.91±0.25,0.74±0.13,0.67±0.21,0.59±0.18),差异具有统计学意义(t=25.652~54.588,均P<0.05)。癌组织中IGF2BP1(70.00%),PEG10(72.00%)蛋白阳性率高于癌旁组织(100%,9.00%),差异具有统计学意义(χ^(2)=75.000,82.363,均P<0.05)。EC中IGF2BP1 mRNA,PEG10 mRNA表达与PCNA mRNA,cyclinD1 mRNA,CDK4 mRNA表达呈正相关(r=0.562~0.625,均P<0.05)。EC中IGF2BP1 mRNA与PEG10 mRNA表达呈显著正相关(r=0.663,P<0.05)。FIGO分期Ⅲ期、并发淋巴结转移EC癌组织中IGF2BP1(86.49%,87.50%),PEG10(89.19%,90.63%)阳性率高于FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期(60.32%,61.90%)、无淋巴结转移(61.77%,63.24%),差异具有统计学意义(χ^(2)=6.863~8.608,均P<0.05)。IGF2BP1阳性组患者三年总体生存率70.00%(49/70)低于阴性组的90.00%(27/30);PEG10阳性组患者三年总体生存率为69.44%(50/72),低于阴性组的92.86%(26/28),差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=4.133,5.491,P=0.042,0.019)。FIGO分期Ⅲ期(OR=1.449,95%CI:1.148~1.830)、并发淋巴结转移(OR=1.442,95%CI:1.124~1.850),IGF2BP1阳性(OR=1.637,95%CI:1.239~2.163)及PEG10阳性(OR=1.576,95%CI:1.136~1.187)是影响EC患者生存预后的独立危险因素(均P<0.05)。结论EC中IGF2BP1,PEG10表达升高,两者与增殖基因表达呈正相关,是EC预后评估的肿瘤标志物。

PEG10基因与Wnt/β-catenin信号通路在肝癌发病机制中的相互关系

遗传印记基因10(PEG10)在绝大多数肝癌中特异性高表达,PEG10和SIAH1基因在肝癌细胞中相互作用,过表达的PEG10可抑制SIAH1介导的细胞凋亡,同时SIAH1可显著抑制PEG10的表达,失平衡的二者可能通过抑制细胞凋亡参与肝癌形成。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肝癌形成中起重要作用;而SIAH1降解该通路的关键因子β-连环素(β-catenin),诱导肝癌的细胞凋亡和生长停滞,在抑制肝癌形成中起重要作用。PEG10和β-catenin均与SIAH1密切联系,PEG10的致癌作用很可能部分归因于Wnt/β-catenin信号通路。

人肝癌组织父系表达基因10印记状态与差异性DNA甲基化区甲基化状态的关系

父系表达基因10（paternally expressed gene 10,PEG10）是一个新的父系表达的遗传印记基因，在大多数肝癌组织中有表达，与肝癌发生和发展密切相关。大多数肝癌组织存在PEGIO印记异常，主要表现为双等位基因同时表达的印记丢失。差异性DNA甲基化区（differentially methylated region，DMR）的甲基化状态与印记调控密切相关。一、材料与方法1．组织标本：40份肝癌及其癌旁组织标本来自广西医科大学第一附属医院肝胆血管外科标本库，其所属患者中男36例，女4例，年龄29-76岁，平均（47．3±11．7）岁。每份组织标本均经病理检查证实。2．PEGIO基因型分析：通过DNA-PCR产物测序法从肝癌组织标本中挑选出PEGl0杂合子标本。按通用基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]说明书提取40份肝癌组织基因组DNA。

长链非编码RNA PEG10在结直肠癌中表达的临床意义和生物学功能

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)父系表达遗传印记基因10(paternally expressed 10,PEG10)在人结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中的表达、临床意义及生物学作用。方法利用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法检测66例CRC肿瘤组织及正常癌旁对照组织中lncRNA PEG10 mRNA的表达水平,分析lncRNA PEG10的表达与CRC患者临床病理资料及预后之间的相关性。在体外,利用CCK-8实验、Transwell迁移和侵袭实验检测lncRNA PEG10的表达对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果与癌旁正常对照组织相比,lncRNA PEG10在CRC肿瘤组织中的表达显著升高(P<0.01),并且与CRC患者的肿瘤浸润深度(P=0.017)、淋巴结转移情况(P=0.009)及TNM分期(P<0.001)显著相关。此外,lncRNA PEG10高表达是CRC患者预后的独立危险因素,与CRC患者总生存期(P=0.0037)和无进展生存期(P=0.0019)的减少密切相关。CCK-8细胞活性实验表明,lncRNA PEG10表达干扰能够抑制CRC细胞系HCT-116和DLD-1的增殖能力(均P<0.01);Transwell细胞侵袭实验表明,lncRNA PEG10表达干扰能够抑制CRC细胞系HCT-116和DLD-1的浸润能力(P<0.05或P<0.01);Transwell细胞迁移实验表明,lncRNA PEG10表达干扰能够抑制CRC细胞系HCT-116和DLD-1的转移能力(P<0.05或P<0.01)。结论lncRNA PEG10与CRC患者预后不良密切相关,并且促进CRC细胞的增殖、浸润和转移。lncRNA PEG10靶向治疗或许能够为CRC患者预后的改善带来巨大的益处。