遗传密码子拓展技术在赖氨酸酰化修饰研究中的应用

赖氨酸酰化修饰在细胞中普遍存在,控制着蛋白质的多种功能;然而,在活细胞中进行特定位点酰化修饰的生物学功能研究还存在困难。近年来发展的遗传密码子拓展(genetic code expansion,GCE)技术通过正交的氨酰基-tRNA合成酶/tRNA能够在活细胞内定向插入与天然酰化修饰结构一致的非天然氨基酸(unnatural amino acids,UAAs),实现在精准引入酰化修饰的基础上研究目的蛋白的理化性质和生物学行为的改变。此外,GCE技术还能定点引入无法被去酰化酶识别的模拟酰化修饰的UAAs,从而提高目的蛋白赖氨酸酰化修饰产物的稳定性。在目的蛋白特定位点插入“光交联”型UAA则被用于阐明酰化修饰蛋白的互作蛋白质组。根据不同结构和功能的酰化修饰分类,分别阐述了GCE技术结合上述3类UAAs的新颖设计,及其在研究蛋白酰化修饰对目的蛋白的活性、稳定性、细胞定位、蛋白质-DNA相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用等功能影响中的应用。最后,展望了GCE技术在蛋白质酰化修饰研究中的局限和应用前景。

遗传密码子的通用性与特殊性

遗传密码子的通用性与特殊性是生物多样性的重要分子基础。本文就目前研究较多的热点密码子在线粒体和原生动物纤毛虫中的特殊性进行总结，并对其形成理论机制进行探讨，阐明变异密码子在线粒体中是通用密码子在漫长进化过程中的遗物，但在纤毛虫中则并非单一地由某个时间或从某个种类开始，而是独立多次地在各物种内分别产生。

遗传密码子进化的阶段性

密码子的起源与进化可划分为 4个阶段 ,即 :前密码子期 ,tRNA形成期 ,原密码子与有序肽同步起源期 ,以及密码子进化期 .不同的观点 ,大都能在不同时期找到自己的位置 ,从而是互补的 .在此基础上 ,首次将主要理论的主旨整合为一个进化过程的理论框架 ,基本上协调了持续了近半个世纪的确定论和偶然论之争 。

简并性还是多态性?——遗传密码子设定的进化特点的剖析(英文)

遗传密码子的设定表现出令人困惑的多态性特点 :不同氨基酸拥有的密码子的数目 ,除 5个外 ,从 1个到 6个都有 .这种特点显示出密码子无论在翻译行为还是进化轨迹上 ,都存在诸多的异质性 .因此 ,简并性一词的收敛含义 ,并不能表征这种多态性的进化内涵 .没有同义密码子的AUG(Met)和UGG (Trp)并无简并现象 .其余的密码子则可分为两大类 :一类是 ,4个同义密码子为 1组 ,具有相同的第 1、2位碱基 ,并遵循“3中读 2”的读出规则 .同组的 4个同义密码子 ,不过是来自同一个双字母原始密码子 (XYN)的孑遗物 ,从这个意义上讲 ,也不宜视为简并现象 ;另一类则主要是 ,2个同义密码子为一组 ,并遵循“3中读 3”读出规则 .它们是由编码 2个氨基酸的双义原始密码子 ,第 3位的未定碱基N进一步设定形成 .至于有 6个同义密码子的 ,特别令人困感不解的组别 ,实际上是 4 + 2个 ,这启示它们可能源于上述两大类 .遗传密码子多态性的起源 ,可能始于最初阶段 ,氨基酸同某类寡核苷酸的起始二联体的相互作用 ,而完成于所有的双义原始密码子的第 3位碱基的分化 .这种进化轨迹被传统的简并性一词所模糊 ,并导致鉴定各有关理论可信性的坚实依据和令不同观点取得共识的基础被掩盖起来 .这可能就是在遗传密码子起源领域里 。

遗传密码子扩充系统表达载体及其稳定细胞系的构建

目的:构建异源表达遗传密码子扩充系统的HeLa细胞系。方法:用PCR方法扩增MmBocRS、PyltRNA基因,定向克隆到Lenti-EF1α-Puro载体中,构建Lenti-EF1α-BocRS、Lenti-PyltRNA表达质粒;在HEK293T细胞中进行病毒包装,用获得的慢病毒感染HeLa细胞,获得BocRS-t RNACUA稳定细胞株;分别应用实时定量PCR和Western印迹鉴定该稳定细胞系中MmBocRS和PyltRNA的表达;利用转染EGFP的琥珀突变体验证BocRS-t RNACUA稳定细胞株的功能。结果:酶切及测序表明Lenti-EF1α-BocRS和Lenti-PyltRNA质粒构建正确;实时定量PCR结果显示BocRSt RNACUA稳定细胞株中PyltRNA的表达量显著提高;Western印迹结果显示BocRS-t RNACUA稳定细胞株中MmBocRS基因的表达量明显高于空白对照;转染EGFP琥珀突变体结果表明,可以通过非天然氨基酸来控制EGFP的表达。结论:构建了能稳定表达MmBocRS和PyltRNA的BocRS-t RNACUA细胞株,并实现了通过非天然氨基酸控制蛋白表达,为研究定点插入非天然氨基酸提供了细胞模型。

遗传密码子扩展技术在蛋白质及多肽类药物中的应用

通过遗传密码子扩展技术位点特异性插入非天然氨基酸(noncanonical amino acids,ncAAs)可在原子水平上对蛋白质的结构与功能进行操控。目前该技术能够向包括高等动植物在内的各种生命体中插入200多种ncAAs,已被广泛应用于生物医药领域。凭借能够在蛋白质中定点引入可控生物正交化学官能团的独特优势,该技术不仅可以用于蛋白质及多肽药物的研发,提高蛋白质及多肽药物的质量与疗效,而且可以为一些人类重大疾病的预防和治疗提供开创性解决方案。本文将重点关注遗传密码子扩展技术的前沿进展及其在各类抗体、细胞因子以及抗菌肽等蛋白质及多肽类药物中的应用,同时也对其衍生的新型生物治疗手段进行简单阐述。

兰兽研在基于遗传密码子扩展技术构建重组口蹄疫病毒研究中取得新进展

近日,中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学创新团队通过利用遗传密码子扩展技术构建携带提前终止密码子的重组口蹄疫病毒(PTC-FMDV),揭示了病毒基因组中琥珀终止密码子具有遗传不稳定性。相关内容在《RNA生物学杂志(RNA Biology)》上发表。

多杀性巴氏杆菌的遗传密码子偏好性初步分析

为了研究多杀性巴氏杆菌的遗传密码子偏好性,试验以GenBank中登录的27条多杀性巴氏杆菌功能基因的CDS序列为材料,利用CodonW软件初步分析了多杀性巴氏杆菌密码子的偏好性。结果表明:UUU、UUA、CUU、AUU、GUU、GUA、UCU、UCA、AGU、AGC等28个密码子为多杀性巴氏杆菌的偏好性密码子。

敏捷气热菌密码子及AUG侧翼序列保守性分析

比较敏捷气热菌和大肠杆菌等 9种编码区GC含量 ,以及各异生物的密码子使用情况 .结果表明 ,与敏捷气热菌编码区GC含量比较接近的果蝇 ,在密码子使用上与之相差最小 .它们在分类学上分别属于不同的域 ,与敏捷气热菌同属古菌 ,但GC含量相差较大的强烈炽热球菌 ,则相差较大 .说明编码区GC含量对密码子使用偏好 ,比生物分类学 (系统发育 )地位更重要 .碱基A ,C在高、低表达基因中出现的概率差别较大 ,尤其在 - 1,- 3,- 4和 - 7位点 ;碱基A ,C在调控翻译起始效率中的作用 ,可能大于碱基G ,U .因为碱基G ,U在高表达和低表达基因中 ,其出现的概率差别不大 .高表达和低表达基因起始密码子侧翼序列中 ,某些位点保守性存在差异 ,其中高表达基因 - 4位和 - 3位可能与其高表达特性有关 .

密码子偏性的影响因素及研究意义

密码子偏性是指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象,由于这一现象和遗传信息载体分子DNA和生物功能分子蛋白质相关联,所以具有很重要的意义。综述了密码子偏性的影响因素,并简要介绍了研究密码子偏性的重要意义。

密码子、氨基酸若干重要性质的相关性

对遗传密码子及20种蛋白质氨基酸的若干重要性质的相互关系进行了考察,发现,不仅在密码子和氨基酸内部的多项性质间,而且在密码子与氨基酸两者的多项性质间均存在着显著的相关性.这种相关性在核酸与蛋白质之间逻辑关系的分析方面可能有意义.

华东师范大学中法联合研究首次在脊椎动物中实现遗传密码的稳定扩充

据2016年12月12日华东师范大学生命医学所消息，该所李大力与巴黎第六大学叶世欣和加州大学旧金山分校王磊利用转基因技术等手段，在世界上首次构建了具备遗传密码子扩充能力的转基因小鼠和斑马鱼，证明在脊椎动物中扩充遗传密码子是稳定可行的，从而显著提高遗传密码子扩充技术在高等动物中深度探索的可行性。

例谈基因表达中密码子与tRNA相关问题的不确定性

梳理相关文献资料,简要总结遗传密码的特殊性。分别从tRNA的结构、运载氨基酸种类、反密码子类型、tRNA的多种功能等4个角度说明tRNA种类的不确定性。

牛磺酸在鱼类中的生物学功能

牛磺酸（Taurine），又称为牛胆酸，是一种非蛋白氨基酸，无遗传密码子，不组成蛋白质和酶类，因最早于1827年从牛胆汁中分离而得名。牛磺酸系小分子含硫氨基酸，化学名为2．氨基乙磺酸，结构式为H2N-CH2-CH2-S03H，相对分子质量为125．4，常温常压下牛磺酸纯品为无色四面针状结晶，无臭，

抗天牛基因cryⅢA的改造及人工合成

采用中国林科院林业研究所生物技术室开发的核酸序列分析软件tRNASYSTEM分析了4000个杨树形成层基因氨基酸的三联体遗传密码,得出了一套适合于在杨树形成层高效表达的密码子,并通过该密码子,对从苏云金芽孢杆菌菌株Bt.886中克隆的、具有抗天牛作用的cry A基因进行了改造.在两端加上合适的酶切位点后,人工合成了最长为90bp的小片段,再经PCR延伸及T4连接酶拼接成全长为1812bp的基因.利用两端设计的酶切位点,将全长基因克隆到克隆载体PUC119上,为进一步用于在杨树形成层特异表达的研究打下了基础.

抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响,利用PCR重叠延伸法,对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变,构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明,PCR产物全长240bp,有一个阅读框,编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成。突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比,在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA),第5号氨基酸Gln相差一个碱基(CAG→CAA),第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA)。重新合成引物,将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b(+)分别重组到大肠杆菌BL21菌株。IPTG诱导后,二者均得到了表达。软件分析显示,突变前pETAFPo表达产物占全菌蛋白的3％,突变后pETAFPm的表达产物占全菌蛋白含量的8％;表达蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经超声波破碎后,蛋白质复性,抑菌结果表明,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比,已有效地提高表达量。

5′—脱氧单核苷酸分离制备工艺的研究

采用20■×8的离子交换层析柱(氯型,200～400目;柱高×柱截面为10.5cm×16cm^2)可将 Penicillium citrinnm变异菌株产生的核酸酶 P_1对鱼精 DNA 钠盐的酶解产物——四种脱氧单核苷酸完全分离。其分离工艺条件是:0.0018N HCl,0.0028N HCl,0.035N NaCl(pH6)和0.02M NaCl—0.005N HCl(dCMP→dAMP→dTMP→dGMP);酶解液浓度2.3mg/ml左右;加样流速0.1～0.2ml/cm^2·min;洗脱流速0.5ml 左右/cm^2·min。