超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器遗传毒性化合物检测方法优化

基于酵母DNA损伤响应机制,本实验室构建了超敏感型酵母HUG1-yEGFP生物传感器,检测方法主要依靠流式细胞仪.为了简化检测方法,实现高通量检测,本研究通过摸索和测试各种条件,建立了优化的、更适合于96孔板的荧光酶标仪的检测方法.结果显示:F1培养基可以作为一种本底荧光较低的培养基用于荧光酶标仪的检测,使用96孔透明底黑色细胞培养板的检测菌液体积为100μL,初始菌液浓度OD600 nm值为0.05.在此优化检测条件下,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器与典型的遗传毒性化合物甲磺酸甲酯(MMS)可以建立良好的剂效和时效关系,说明该生物传感器已具备了实际应用的实验基础.

过表达ERCC1蛋白细胞系的建立

[目的 ]建立过表达ERCC1蛋白的细胞系 ,为遗传毒性化合物的研究提供模型细胞系 ,并有可能为具有DNA加合作用化合物提供新的毒理学筛选方法。 [方法 ]应用PCR和DNA重组技术将核苷酸切除修复交叉互补组 1 (Excisionrepaircrosscomplementationgroup1 ,ERCC1 )基因与pT7Blue载体相连接 ,然后构建真核细胞重组表达质粒 pcDNA3.1 /Zeo(+) -ERCC1 ,并导入 2 93细胞。经Zeocin抗性筛选后获得转染ERCC1基因的细胞克隆。细胞增殖后以Western -blot检测目的蛋白的表达。 [结果 ]获得稳定转染ERCC1基因的细胞系 ,并在细胞中检测出有ERCC1蛋白的过表达。 [结论 ]用基因转染法成功建立了过表达ERCC1蛋白的ERCC1 - 2