对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶(黑曲霉)活力的方法

旨在建立一种适合于测定饲用α-半乳糖苷酶活力的检测方法。实验利用对硝基酚 -α- D-吡喃半乳糖(p- NPG)作为酶反应底物 ,通过 4 0 0 nm比色检测酶反应所释放的对硝基酚的量来测定饲用酶制剂中 α-半乳糖苷酶的活性。研究表明 ,反应液中所含的对硝基酚的量大于 15 μmol.m L-1时 ,吸光值超过仪器的检测范围 ;酶制剂稀释倍数对对硝基酚比色法的影响较小 ,本底占总酶活的 10 %～ 16 % ,当酶稀释 10 0倍时 ,本底对酶活的影响最小 ;在测定酶活反应时间为 6 min时 ,已经有约 10 %的对硝基酚 - α- D-吡喃半乳糖水解 ,当酶液的酶活在 2 .0 U.m L-1以内 ,测试结果较为准确。考虑到饲用酶制剂的作用环境 ,建议反应温度为 37℃、反应体系 p H 5 .0。

黑曲霉耐酸性α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

采用耐酸性黑曲霉(Aspergillus niger L.)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过聚乙二醇6000-KH2PO4双水相萃取、Sephadex G-100凝胶过滤,获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化倍数为36.4,总酶活力回收率达到70%。凝胶过滤表明:该酶表观分子质量为125kD,SDS-PAGE显示其分子质量为58.5kD。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.0,最适温度为65℃,表观Km值为0.915mmol/L,表观kcat/Km值为1.07×105L/(mol.s);水解蜜二糖的表观Km、kcat/Km值分别是21.0mmol/L、9.96×103L/(mol.s);对棉子糖只有微弱的水解作用。水解活性受多种金属离子的普遍抑制,其中Fe3+、Fe2+、Mn2+、Hg+等强烈抑制酶活力。该酶活力在pH1.5～8.2保持稳定,在60℃时保温60min,剩余酶活力达到了60%,是一种热稳定酸性α-半乳糖苷酶。

根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉(Rhizopus sp.A03)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10~4 mol-1/(L·s);水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/(h·mg);水解活性受Fe^(3+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)和Hg^+等离子的强烈抑制,但Fe^(2+)对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。

两种乳糖酶活力测定方法比较

邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)法和双糖酶法是常用的乳糖酶活力测定方法,本文对这两种方法的线性范围、检出限、精密度、准确度和稳定性进行了比较。结果显示,ONPG法在线性范围、检出限、精密度以及稳定性方面均优于双糖酶法,但此种方法的重复性较差,需要进一步的优化。对比这两种方法,可为乳糖酶活力测定方法的合理选取提供参考。

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种金属离子的明显抑制,其中Ca2+、Cu2+、Fe3+、Hg+、Mn2+等几乎完全抑制酶活性。该酶活性在pH4.5-9.0保持稳定,在55℃时保温120min,酶活残留48%。

基于酵母双杂交的微囊藻毒素检测系统初探

微囊藻毒素是由淡水微囊藻产生的次生代谢物,结构为环状七肽,分子量约1000Da,对生物机体具有多种毒理作用,是一类较强的肿瘤促进剂,目前没有比较简单便宜的藻毒素检测方法,本文探索建立利用酵母双杂交系统进行藻毒素检测的方法。前期实验已用噬菌体表面展示肽库技术从随机12和7肽库中筛选获得若干与藻毒素有相互作用的多肽。本文分别挑选其中亲和力较高的3个多肽,构建到酵母双杂交系统中,将不同的肽段分别融合在含有Ac-tive Domain和Binding Domain的表达载体中,共转化酵母菌株AH109,然后测定β-半乳糖苷酶活性来反映下游报告基因半乳糖苷酶的表达情况,从而通过反映培养基里面是否含有藻毒素,进而利用此方法来比较方便地检测藻毒素。