邻苯二酚双加氧酶传感器的研究

洋葱伯克霍尔德氏菌L68的细胞裂解液经硫酸铵分级沉淀后,依次经DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析,Hydroxyapatite柱层析和Sephadex G-150 凝胶过滤分离,提取到邻苯二酚双加氧酶.经SDS-PAGE检测,达到电泳纯.将酶反应与氧电极偶联,研究了检测水体中邻苯二酚的邻苯二酚双加氧酶传感器.以100mmol/L磷酸钠标准缓冲液(pH7.24)作为该酶传感器的的工作介质,在25℃条件下测得传感器对邻苯二酚标准液的工作曲线线性范围为0.2～3mmol/L,检测限为0.05mmol/L,响应时间为1min,平均回收率达到1.03%.

不动杆菌JH250-8邻苯二酚双加氧酶基因的克隆及分析

目的研究不动杆菌JH250-8的石油降解机制,克隆并分析其邻苯二酚双加氧酶基因.方法应用数据库的同源序列设计引物,对不动杆菌JH250-8邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)基因进行扩增,并用生物信息学软件及在线生物分析工具等分析编码蛋白质.结果不动杆菌JH250-8中同时含有C12O和C23O两种邻苯二酚双加氧酶;扩增的DNA序列长度分别为1 299和1 118 bp,蛋白质编码区长度为1047和930 bp,分别编码358和309个氨基酸;两个邻苯二酚双加氧酶等电点(p I)分别为5.03和4.79,均为酸性蛋白质;酶分子中都含有较多极性和可电离氨基酸,在水中有较好的溶解性,但由于N端都有一段疏水性肽段,可能会影响其水溶液的稳定性;在蛋白质二级结构上,两个酶分子中都有较丰富的二级结构单元,既有较好的稳定性,又有较好的底物适应性.C12O的三级结构由同型二聚体构成,每个亚基上都结合有Fe3+;C23O三级结构的核心由两组β-折叠构成,另有4个α-螺旋结构分布于外侧.结论不动杆菌JH250-8有两种邻苯二酚双加氧酶,两种酶均为酸性蛋白质,有较好的水溶性及结构稳定性.分析结果对邻苯二酚双加氧酶的后续研究有重要的参考价值及指导意义.

邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物 ,以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板 ,扩增出邻苯二酚 2 ,3-双加氧酶 (C2 3O)基因 .将该基因和表达载体pET - 30a(+)连接 ,转化E .coliJM10 9(DE3) ,获得了高效表达的转化子 .SDS -PAGE结果表明 ,转化子的C2 3O蛋白不仅在细胞内存在 ,而且能被分泌到胞外 ,薄层扫描显示 ,转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的 4 2 % .酶活分析表明 ,分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C2 3O比活力 .Southern杂交将菌株ZL5的C2 3O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上 .图 5表 1参

石油污染土壤中芳烃降解菌及邻苯二酚2,3双加氧酶的克隆

石油污染土壤中的芳烃降解菌是进行土壤修复的主要生物资源,本研究对某炼油厂附近土壤中的芳烃降解菌及邻苯二酚2,3双加氧酶基因进行了研究。结果表明,部分石油烃污染土壤中存在着大量的芳烃降解菌;对其中一个土壤样本中的邻苯二酚2,3双加氧酶基因进行克隆,获得了7个不同的邻苯二酚双加氧酶基因序列,序列分析表明这些基因可能来源于土壤中的假单胞菌,且该基因在土壤中的丰度与污染水平及芳烃降解菌的数量相关。可见,土壤中芳烃降解菌数量及降解基因的丰度和多样性,可以对石油污染土壤的生物修复进行监控并为生物修复提供丰富的微生物资源。

降解1,2,4-三氯苯的硝基还原假单胞菌J5-1的分离鉴定和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的克隆

从受氯苯污染的土壤中分离到1株以1,2,4-三氯苯为唯一碳源生长的细菌,命名为J5-1.根据其生理生化特征和16SrDNA(GenBank Accession No.EF107515)序列相似性分析,将该菌株初步鉴定为硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens).当1,2,4-三氯苯初始浓度为400 mg/L时,J5-1对其最大降解率接近90%;当1,2,4-三氯苯浓度初始为20 mg/L时,降解效果最好.J5-1对1,2,4-TCB的降解服从一级反应动力学.从J5-1的基因组DNA中克隆到CC12O的全长序列.

洋葱伯克霍尔德氏菌产邻苯二酚2,3-双加氧酶的研究

对洋葱伯克霍尔德氏菌L 68生长及产邻苯二酚2,3 双加氧酶(C23D)的条件进行了研究,其最适产酶pH7.2;最适生长温度30～35℃;最适培养时间48h;苯酚浓度0.09%最有利于菌体产酶.对菌株L 68产生的C23D酶进行了纯化,超声波破碎后的细胞提取液经硫酸铵分级沉淀、DEAESepharoseFastFlow层析、Hydroxyapatite层析、SephadexG 150层析后,收率为20%,酶比活力提高了230倍.SDS PAGE检测得到了分子量为(34±1)kDa的蛋白.

L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶纯化及性质

L68菌株中的邻苯二酚 2 ,3 双加氧酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE SepharoseFastFlow柱层析、Hydroxyapatite柱层析、Sephadex G15 0凝胶过滤分离 ,并经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ,达到了电泳纯 .提纯倍数为 2 34 .1倍 ,收率为 2 0 .2 % .酶相对分子质量为 (132± 10 )kDa ,由 4个相对分子质量相同的亚基组成 .最适反应温度 35℃ ,且酶活力在 15～ 65℃比较稳定 ;最适 pH为 8.0 ,在 pH 7.0～ 10 .5酶活力较高且比较稳定 .某些金属离子尤其是Fe3+ 对酶活力有强烈的抑制作用 .以邻苯二酚为底物 ,Km 为 2 0 .63μmol/L ,Vmax为 2 .82 μmol/ (min·mg)

洋葱伯克霍尔德氏菌L68邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、表达和纯化

采用自行设计的引物,从洋葱伯克霍尔德氏菌L68中PCR扩增得到phnE(邻苯二酚2,3-双加氧酶)基因,亚克隆到高表达载体pET 32a上,转入表达菌株中。经双向测序,证实构建过程中未出现突变。重组子经IPTG诱导后,可以表达有活性的重组双加氧酶。选择26℃进行重组蛋白诱导。薄层扫描显示,表达重组蛋白总量最高可占总蛋白的64.92%。利用金属螯合层析对重组蛋白进行了一步纯化,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白纯度达到95%。

点突变Pro229Ser和Glu243Gly对耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶性质的影响

采用ＰＣＲ随机诱变方法，研究氨基酸置换对耐热邻苯二酚２，３－双加氧酶性质的影响。 比较分析了突变体Ｐｒｏ２２９Ｓｅｒ和Ｇｌｕ２４３Ｇｌｙ与野生型酶的酶学性质。结果显示点突变 Ｐｒｏ２２９→Ｓｅｒ或Ｇｌｕ２４３→Ｇｌｙ并未改变酶的最适反应温度（均为６０℃）；突变体Ｐｒｏ２２９Ｓｅｒ （Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝ ４．８９ ± ０．０１ × １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）以及突变体 Ｇｌｕ２４３Ｇｌｙ（Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝ ５． ８８±０． ０１× １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）的催化能力与野生型酶（Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝６．９７±０．０１× １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）相比有所下 降；点突变Ｐｒｏ２２９→Ｓｅｒ大幅度降低了酶的热稳定性（△Ｔｍ≈ １０．２℃），而点突变Ｇｌｕ２４３－Ｇｌｙ 对酶的热稳定性影响较小（△Ｔｍ≈１．５℃）。推测Ｐｒｏ２２９对耐热邻苯二酚２，３－双加氧酶的热稳 定性有重要贡献。

假单胞菌ZL13邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的克隆表达

寻找新型高效石油降解菌,并研究其相关基因一直是石油降解领域的热点.本文以细菌Pseudomonas sp.ZL13的降解性质粒pZL-1的DNA为模板,通过PCR扩增的方法进行基因克隆,得到邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.序列分析结果表明,该基因大小为924bp,编码307个氨基酸;序列同源性比较结果显示,该基因与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因序列的相似性较高,处于同一分支.将目的基因连接到pGEX-4T-2表达载体上,在E.coli BL21中成功表达,转化子具有原油降解能力.

不同细菌中邻苯二酚2，3-双加氧酶基因的研究

芳烃类化合物是较强的致癌物质之一，对人体危害极大。邻苯二酚是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。邻苯二酚2，3-双加氧酶(CatO2 ase)也叫变儿茶酚酶(MPC)，存在于一些能分解芳香族化合物的细菌中，它能催化苯环的邻位裂解，将无色或微棕色的邻苯二酚转变成黄色的2-羟粘糠酸半醛(HMS)，

苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp.strain PNAN5)的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究

分离到一株能以苯酚、苯甲酸、对甲酚、萘为唯一碳源和能源生长、具有同时降解单环和双环芳烃能力的细菌菌株,经生理生化、16SrRNA基因序列分析等鉴定为红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp.strainPNAN5).在实验条件下和在温度为20～40℃、pH7 0～9 0范围内菌株PNAN5降解苯酚的效率保持在80%～100%之间,苯酚浓度在2～10mmol·L-1范围内变化对降解效率没有明显的影响.该菌株通过邻苯二酚1,2 双加氧酶催化的开环途径降解芳烃,不同于已知的浑浊红球菌(R.opacus)是通过邻苯二酚2,3 双加氧酶催化芳烃降解.以细胞裂解液测定该酶的酶促反应动力学常数Km值为35 94μmol·L-1,Vmax为0 84μmol·L-1·min-1·mg-1.

石油烃降解菌对邻苯二酚、苯甲酸钠降解特性的研究

邻苯二酚和苯甲酸是苯类化合物代谢过程中两种常见的中间产物,也是工业废水中常见的环境污染物。为了高效去除苯类污染物,考察了高效降解石油中芳香烃组分的菌株 Acinetobacter sp. Tust-DM21 对邻苯二酚和苯甲酸钠的降解,并通过邻苯二酚 1, 2-双加氧酶(C12O)的粗酶特性和苯甲酸 1, 2-双加氧酶的酶活初步研究其代谢过程。在不含碳源无机盐培养基中,菌株 Tust-DM21 能够分别以邻苯二酚和苯甲酸钠为唯一碳源进行生长。通过改变接菌量、底物浓度、pH、温度等方面对该菌降解这两类苯类物质的特性进行研究,对 C12O 的最适 pH、温度和动力学参数以及苯甲酸 1, 2-双加氧酶的酶活进行分析。菌株对邻苯二酚的最大耐受浓度为 700 mg/L,菌株降解 600 mg/L 邻苯二酚的最佳条件为:接菌量 5%、pH6.0、温度 35℃,降解率达 92%以上。菌株可耐受 4 500 mg/L 苯甲酸钠,降解浓度为 1 500 mg/L 苯甲酸钠的最佳条件为:接菌量 3%、pH8.0、温度 35℃,降解率达 95%以上。C12O 的最适 pH 为 8.0,温度 35℃,其动力学参数为 Km=25.68 μmol/L,Vmax=0.131 mol/(mL min);苯甲酸 1, 2-双加氧酶的酶活为 3.53 U。该菌对邻苯二酚、苯甲酸钠有良好的降解效果,具有潜在的应用前景。

氯代邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的克隆及其定量表达

从1,2,4-三氯苯降解菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)J5-2的总DNA中,利用PCR方法克隆到氯代邻苯二酚1,2-双加氧酶基因,命名为tcbC(J5-2)(GenBank登录号EF111021).分析tcbC(J5-2)基因的氨基酸序列后发现,该基因不同于已见报道的1,2,4-三氯苯降解菌Pseudomonas sp.P51中的氯代邻苯二酚1,2-双加氧酶基因tcbC(P51),与其同源性仅为95%.tcbC(J5-2)基因在48、52和73这3个关键位置的氨基酸分别为Leu(亮氨酸)、Ala(丙氨酸)和Ile(异亮氨酸),而tcbC(P51)基因分别为Val(缬氨酸)、Ala(丙氨酸)和Met(蛋氨酸).利用实时荧光定量反转录-PCR(real-time reverse transcription-PCR)方法,考察了菌株J5-2在分别以1,2-二氯苯、1,3-二氯苯和1,2,4-三氯苯为唯一碳源时tcbC(J5-2)基因的定量表达.结果表明,1,2,4-三氯苯对tcbC基因的诱导作用更强.

应用多波长反常散射法测定耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的晶体结构

运用基因工程技术,将耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶（TC23O）分子中的甲硫氨酸（Met）全部置换为甲硒氨酸（SeMet）.培养出甲硒氨酸置换的耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶（SeMet-TC23O）的晶体.利用同步辐射光源收集了SeMet-TC23O 晶体的X射线衍射数据,应用多波长反常散射方法测定了TC23O0.3mm的晶体结构.结果显示,TC23O分子为同源四聚体结构,每个单体由相对独立的N-端结构域（1～153位氨基酸残基）和C-端结构域（153～319位氨基酸残基）构成.每个结构域含有两个在此类酶中具有特征性的βαβββ结构花样.两个结构域可根据分子内非晶体学对称轴近似叠合.

粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s^(-1);Fe^(2+)、Hg^(2+)、Cu^(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。

邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、功能及同工酶现象研究进展

邻苯二酚是芳香族化合物多条生物降解途径中共有的一种重要的中间产物,根据开环方式的不同,可分为邻位降解途径和间位降解途径,其中邻位降解途径中的关键酶是邻苯二酚1,2-双加氧酶。本文主要综述了邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、酶学性质,以及它在芳香烃降解菌中存在的同工酶现象及其功能研究进展。

邻单胞菌邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfdC)在拟南芥中表达的初步研究

将从一株邻单胞菌中克隆到的一个新的邻苯二酚 1,2 双加氧酶基因 (tfdC)的起始密码子由GTG突变成ATG ,并克隆到农杆菌双元载体 pPZPY12 2中 ,利用农杆菌介导转化模式植物拟南芥 ,获得了转化植株 .经过PCR ,PCR Southern和Southerndotblot方法检测证实 ,tfdC基因已经整合到拟南芥基因组中 .邻苯二酚 1,2 双加氧酶酶活性检测表明 ,转基因植株具有一定的酶活性 。

邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达

为了构建能够稳定遗传且高效降解多环芳烃的工程菌,利用PCR技术对Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)基因进行克隆,并将其与自杀性载体pUTmini-Tn5连接,得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O。在三亲接合作用下,经mini-Tn5转座子将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株Pseudomonas sp. wp4的染色体DNA中,最终得到基因工程菌wp4-C23O。在不同pH、温度下,菌株wp4和工程菌wp4-C23O对浓度为50 mg?L-1的芘进行降解7 d。2株菌降解最适温度为37℃、最适pH为7.5。在此条件下,工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于wp4菌株(P<0.05),降解率提高11.45%。以PAHs降解优势菌株为受体构建工程菌可以去除石油污染土壤中的PAHs。

PCR一步法构建融合蛋白基因fpg

采用一种不需要限制核酸酶和连接酶的新方法———"PCR一步法"将芳香烃化合物降解的关键基因pheB和绿色荧光蛋白编码基因gfp融合,构建得到融合蛋白基因fpg。该方法在一个PCR反应体系中通过3个引物、两个模板扩增得到一个含有中间柔性肽段 Gly4Ser 的融合基因fpg。研究结果表明,PCR一步法是一种快速方便的构建融合基因的方法。