利用TurboID邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法

TurboID邻近蛋白标记(TurboID-based proximity labeling,TbPL)技术是将诱饵蛋白融合TurboID生物素连接酶,在该工具酶的作用下将生物素标记到邻近蛋白上,最终通过链酶亲和素偶连磁珠将邻近蛋白富集下来,通过质谱分析的方式获得互作蛋白组。本文主要以水稻重要转录因子OsWRKY53为例,详细描述了利用TbPL技术获得水稻互作蛋白组的方法和注意事项。

邻近标记技术在蛋白质-蛋白质相互作用中的研究进展

蛋白邻近标记(proximity labeling,PL)技术是指通过融合特定的催化酶,实现对目标蛋白相互作用蛋白的原位标记,再采用质谱或测序分析鉴定标记蛋白。该技术能够在瞬时动态条件下精确识别蛋白质相互作用,是传统分析手段的重要补充,在蛋白质相互作用研究中具有广阔应用前景。本文介绍了各类PL酶的工作原理、分类及优缺点;论述了该技术在研究蛋白质与蛋白质相互作用中的应用;讨论了PL技术的优势、目前存在的问题和发展趋势,以期为该技术的应用提供参考。

一种细胞内快速标记邻近蛋白复合物的新方法

目的构建可诱导、细胞适用性广的细胞内快速标记邻近蛋白复合物新方法。方法体外合成TurboID编码基因,并与Tet-on系统一并插入改造后的慢病毒载体,病毒包装后侵染HeLa细胞以融合表达TurboID及目的蛋白YB1或对照蛋白GFP。使用不同浓度的强力霉素处理细胞24h以诱导融合蛋白的表达,加入50μmol/L生物素继续培养15~120min以使TurboID将临近蛋白进行生物素标记,免疫印迹法检测生物素标记的蛋白含量。结果成功构建了可诱导的TurboID融合表达慢病毒载体。获得的病毒侵染HeLa细胞,应用0.125μg/ml以上的强力霉素即可诱导细胞产生TurboID融合蛋白。生物素处理15min以上可得到大量生物素标记的蛋白。结论构建了快速标记邻近蛋白复合物的检测体系——TurboID系统,该系统具有可诱导、生物素标记迅速及细胞适用性广等优点,可广泛应用于大多数动物及人体细胞内蛋白复合物的筛查研究。

BioID技术在肿瘤蛋白质组学中的发展与应用

蛋白质通过形成复合物或蛋白-蛋白相互作用来执行生物学功能,蛋白-蛋白相互作用是细胞生命活动的基础,也是整个生物学领域研究的核心问题之一。传统的互作蛋白筛选方法包括酵母双杂交和串联亲和纯化等,但这些方法具有一定的局限性,很难适用于实时和动态蛋白相互作用分析。邻近依赖生物素鉴定(BioID,proximity-dependent biotin identification)是筛选活细胞中发生的蛋白相互作用的独特方法,利用修饰过的生物素连接酶BirA与感兴趣的蛋白融合表达,生物素化近端内源蛋白质,生物素化的蛋白可以被选择性分离并用生物质谱鉴定出目标蛋白的候选相互作用物。BioID已成功应用于不溶性蛋白及瞬时或弱相互作用蛋白的研究,也逐渐应用于肿瘤等疾病发生机制及药物靶点筛选的研究。文章针对该技术进行了详细总结,并讨论了其在肿瘤蛋白质组学中的应用。