基于外泌体的适配体传感器的构建与应用

基于外泌体的适配体传感器的检测方法具有快速、灵敏、高通量、无创或微创、液体活组织检查和经济高效的分析等诸多优势,成为近年研究热点。综述了目前适配体在检测外泌体、外泌体靶向递送领域的研究进展。首先,介绍了外泌体、适配体和适配体传感器,以及近年常用的适配体筛选技术;其次,阐述基于外泌体的适配体传感器的构建及原理、适配体在外泌体领域的应用;最后,针对目前适配体在外泌体应用领域提出了所遇到的问题和挑战。

指数级富集配体的系统进化技术筛选高转移肝癌细胞HCCLM3的ssDNA适配子

目的采用指数级富集配体的系统进化(SELEX)技术筛选高转移肝癌细胞HCCLM3的ssDNA适配子。方法构建长度为71 nt的随机文库,中间为25 bp的随机序列,通过12轮反复的SELEX筛选获得特异性结合HCCLM3细胞的ssDNA适配子,并初步测定筛选的适配子与细胞的亲和力,对结合力高的适配子进行克隆测序,用RNA structure 5.3分析适配子序列的二级结构。结果经过12轮正向筛选及6轮低转移肝癌细胞MHCC97-L的反筛后,获得了与HCCLM3细胞具有高亲和力的ssDNA适配子;将第12轮ssDNA经克隆测序获得10条测序结果,其中有4条序列一致,另外有2条序列也一致;二级结构预测可知ssDNA适配子二级结构主要以"发夹型"构型为主。结论成功筛选获得了高亲和力的转移肝癌细胞HCCLM3 ssDNA适配子,为实现适配子靶向性治疗奠定了一定的理论基础。

核酸适配体技术在食品重金属检测中的应用研究进展

近年来食品中重金属超标对人们健康构成了威胁,所以对食品中重金属检测技术的开发成为了重要研究内容。虽然传统的检测技术对重金属进行了高选择性和高灵敏度的检测,但是仍需要一种简单、快速、有效、成本低廉的方法用于食品安全领域的快速检测。核酸适配体为一段单链DNA或者RNA序列,是经体外筛选技术筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适配体具有靶分子广、灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点,因而被广泛用于食品安全检测领域。本文综述近年来核酸适配体技术对食品中Hg2+、As3+、Pb2+的检测,并对核酸适体技术在食品重金属检测领域的应用前景进行了展望。

核酸适配子在IgE检测中的应用

核酸适配子是一类经SELEX技术筛选出来的寡聚核苷酸,其功能与单克隆抗体类似但在诸多方面明显优于抗体,可用于测定靶物质含量等。免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)是介导过敏反应的关键因子,IgE定量检测是临床诊断过敏性疾病的重要指标。该文主要综述了核酸适配子在IgE检测中的应用。

嘌呤信号转导研究的新方法

ATP(adenosine 5’-triphophate)是一种嘌呤类物质,参与神经传递和神经调节。随着嘌呤、嘧啶受体亚家族研究的深入,ATP及其受体可能是多种疾病防治的潜在药物靶点。体外研究应用共振能量转移技术,指数级富集的配体系统进化技术及在体小干扰RNA技术可拓宽嘌呤信号转导研究的视野,也将推动其在疾病防治及药物筛选方面的研究进展。

核酸适配子及其在阿尔茨海默病研究中的应用

核酸适配子是一类寡核苷酸分子,它可由指数级富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选寡核苷酸文库而获得。适配子通过与靶分子特异结合,可起到识别或抑制靶分子生物学活性的作用。近年来,越来越多的适配子不断被应用于阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的研究。本文将对近年来核酸适配子在阿尔茨海默病诊断和治疗的研究进展作一综述。

适体生物传感器研究进展

随着功能基因组研究的不断深入以及蛋白质组研究的迅速崛起,核酸与蛋白质之间的相互作用研究已得到了广泛的关注.近年来利用指数级富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)研究人员已经筛选出许多与蛋白等靶分子特异性结合的核酸配基,并将这种能与有机物或蛋白质等靶分子专一、高效结合的RNA或DNA片段称之为适体(aptamer).

SSCP在寡核苷酸适配子ssDNA多克隆筛选中的应用

目的利用单链构象多态性技术弥补SELEX(systematic evolution of ligands by exponential en-richment,SELEX)实验在寡核苷酸适配子克隆、测序环节中的不足,减少SELEX实验的环节。方法利用单链构象多态性技术(singel-strand conformation polymorphism,SSCP)将多轮SELEX筛选的198个寡核苷酸适配子克隆在测序前进行SSCP筛查。结果对198个克隆的SSCP电泳条带位置分析,挑选出58个克隆测序。SSCP筛查得到有效克隆的检出率为20.69%,是不用SSCP筛查检出率6.07%的3.4倍;如果去除组间误差,有效克隆的检出率44.44%是不用SSCP筛查检出率的7.32倍。结论通过对198个克隆的20批次SSCP电泳筛查,并经58个克隆测序后的实验结果证明:同一SSCP电泳胶片上电泳条带泳动位置相同的克隆片段,基因序列相同;电泳条带泳动位置不同的片段,基因序列不同。根据SSCP电泳条带泳动位置,挑选有代表性的克隆测序,避免对多克隆盲目测序,为多克隆测序前的筛查探索一条新的途径。

肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体的筛选及其鉴定

目的筛选和鉴定肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体(Apt)。方法采用配体指数级富集系统进化(SELEX)技术,以DKK1为靶蛋白,羧基化琼脂磁珠为筛选介质,从随机ssDNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适体。利用生物信息学方法对核酸适体进行序列分析和二级结构预测,表面等离子体共振仪分析测定核酸适体的亲和力。结果经过6轮消减SELEX筛选,次级ssDNA文库与DKK1靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第6轮筛选产物经PCR扩增进行高通量测序。表面等离子体共振仪检测结果表明,筛选得到的DKK1核酸适体与DKK1的结合解离常数均在纳摩尔级水平,Apt-5的Kd值最小,亲和力最高,Apt-26和Apt-28核酸适体亲和力相对较弱。二级结构预测分析表明,茎环和茎凸环结构为主要的结构形式。圆二色光谱分析结果显示,3个候选核酸适体(Apt-5,Apt-26,Apt-28)能特异形成G-四链体结构识别DKK1靶标蛋白。结论获得了与DKK1靶标蛋白特异性结合的核酸适体,为后续核酸适体的应用研究以及DKK1蛋白功能的研究奠定了基础。

Cε3-Cε4蛋白核酸适配子筛选与鉴定

设计并合成随机ssDNA文库,以硝酸纤维素膜为筛选介质,利用SELEX技术筛选人Cε3-Cε4蛋白特异性高亲和力核酸适配子,通过对退火温度、循环次数及靶蛋白与ssDNA摩尔比等关键参数进行优化,建立了适合的筛选体系。ELISA测定各适配子亲和力,获得了人Cε3-Cε4蛋白高亲和力、高特异性适配子,并分析了其一级结构和二级结构。以所获高亲和力适配子分别作为捕获适配子和检测适配子,建立了酶联适配子吸附试验(enzyme-linked aptamers sorption assay,ELASA)方法,灵敏度达到120 ng.mL-1,可用于人IgE的定量检测。

结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的筛选与亲和性分析

目的通过建立指数级富集配体的系统进化技术(SELEX),筛选结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的方法,获得ESAT-6的高亲和性适体,为结核病诊断和治疗试剂的开发奠定基础。方法体外构建一个长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,SELEX技术筛选获得ESAT-6的适体库,将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,找出高亲和性适体。结果经过13轮筛选,ssDNA文库与ESAT-6亲和力从0.257提高到1.163,且12轮后A值趋于平衡,克隆、测序获得ESAT-6的高亲和性适体,其中适体A10亲和力最高,达到1.515,且与CFP10-ESAT6融合蛋白无交叉反应。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与ESAT-6结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了ESAT-6的高亲和性适体。

SELEX技术在神经系统疾病研究中的应用

配体指数级富集系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术是一种组合化学技术,可经过反复筛选扩增得到针对靶分子的高亲和力和高特异性的适配子.适配子通过识别、结合特定靶分子并对其进行功能调控从而达到对疾病诊断和治疗的目的 .近年来SELEX技术在神经系统功能和疾病研究中的应用越来越多.现已经筛选出针对朊蛋白、肌腱蛋白-C、β-淀粉样肽、乙酰胆碱受体的自身抗体等靶标的适配子,促进了对朊病毒病、脑肿瘤、阿茨海默病、重症肌无力等神经系统疾病的诊断和治疗研究,为这些疾病的诊治提供了新的研究工具.

核酸适配子及其治疗应用

核酸适配子(aptamer)是从大容量的组合化学库中筛选出的短的寡核苷酸。与抗体类似,它与靶分子结合具有高特异性和高亲和力。大多数核酸适配子与靶分子结合后对靶分子有抑制作用。适配子可广泛用于抗凝血、抗病毒、抗增殖、抗炎等方面。特异针对人VEGF165的核酸适配子已在美国被批准上市。