放射性配体结合分析法测定鸡视网膜多巴胺D1受体

用放射性配体[3H]SCH23390建立鸡视网膜多巴胺D1受体的放射性配体结合分析法，并测定不同试验组鸡视网膜多巴胺D1受体的Bmax值有显著性差异，KD值无明显差异．同时探讨了干，湿滤膜片对放射性测定结果的影响，以及影响试验结果的其它因素．实验表明湿滤膜片测量效果优于干滤膜片，膜受体即使贮存在-20℃条件下亦只能一周，否则影响受体的活性．

不同种属动物肝细胞膜载脂蛋白CⅢ受体的放射性配体结合分析

目的 探讨不同种属动物肝细胞膜 apo C 受体的存在及结合特性。方法 以 1 2 5I标记的人 apoC 为配体 ,利用放射性配体结合分析法对不同种属动物肝细胞膜与 1 2 5I- apo C 的结合特性进行了初步研究。结果大鼠、狗、羊、猪、兔、鸡、鸽、蛇等动物的肝细胞膜与人 1 2 5I- apo C 有可饱和、高亲合、可逆的结合。竞争性抑制实验表明该结合能被过量非标记 apo C 抑制 ,而人血浆白蛋白对结合无影响。未观察到鲤鱼和牛蛙的肝细胞膜与 1 2 5I-apo C 有可饱和、高亲合的结合。结论 提示肝细胞膜 apo C 受体在进化上具一定保守性。

铁蛋白受体放射配体结合分析法

本文采用差速离心法制备胎盘微绒毛膜，用125I－Hunter试剂联接标记铁蛋白，在国内首次建立了胎盘微绒毛膜铁蛋白受体放射配体分析法，并进行了最适反应条件及铁蛋白受体的特性研究。所标记的125I一铁蛋白放化纯达95％以上，且免疫活性和生物活性均较好。用放射配体受体分析测定了11例正常足月孕妇胎盘微绒毛膜铁蛋白受体数为（3．534土1．105）×1012位点／毫克膜蛋白，亲和力常数Ka为（2．203土0．622）×107mol-1．L。实验条件为：膜蛋白160ug，125I互铁蛋白与游离铁蛋白分离的PEG浓度为12％。对铁蛋白受体特性研究表明：铁蛋白受体与铁蛋白结合具有高度特异性、可饱和性和中度亲和力。

生物样品分析中采用单孔法进行配体结合分析的进展和技术要求

复孔分析是生物样品分析中配体结合分析(LBA)的标准操作方式,其目的是为了降低分析的变异性。随着分析仪器技术的进步和试剂质量的提升,特别是自动化应用,LBA的精密度得到显著提升,生物分析行业提出LBA是否也可以像LC-MS一样采用单孔分析。2019年3月发布的ICH M10(征求意见稿)已接受单孔分析的方式,目前已有多个行业组织或研究机构开展了单孔分析与复孔分析的对比研究,结果表明采用单孔分析并不显著影响毒代动力学(TK)和/或药代动力学(PK)关键参数、抗药抗体(ADA)的临界值以及灵敏度。本文总结现有文献的研究进展,提出单孔分析应用的技术要求,以期为单孔分析应用于TK/PK、以及ADA研究提供参考和借鉴,进一步促进药品注册技术标准与国际接轨。

在配体结合分析中采用单孔分析方法的回顾性研究

该研究回顾性分析了8个配体结合分析项目(5个验证项目和3个样品分析项目)。这些项目涉及3个不同的分析平台[ELISA、单分子免疫阵列(Simoa)和电化学发光免疫分析技术(MSD)]和3种不同的分子类型(单克隆抗体、蛋白类生物标志物和中和抗体药物),对这些项目数据分别采用单孔分析和复孔分析的方式进行检测。分析结果显示,在孔间变异较小(<5%)的情况下,单孔分析和复孔分析方式所得结果之间存在良好的相关性,并且计算得到的主要药动学参数(AUC和c_(max))之间没有显著性差异,可以将单孔分析替代复孔分析应用于上述分析平台。

ADC药物配体结合生物分析常见技术问题探讨

目的:抗体药物偶联物(ADC)是一类新的生物治疗药物,通常由细胞毒性有效载荷通过连接子与抗体共价结合组成。ADC在体内经历不断的脱偶联和生物转化过程,导致形成复杂且结构不均一的混合物,除了脱偶联的游离抗体和游离载荷外,还存在不同程度与小分子药物偶联的ADC分子,因此,对生物分析方法的开发带来很大挑战。为了解ADC药物在非临床和临床研发阶段的药代和药效特征,以及免疫原性和安全性,对给药后体内存在的不同分子形式的实体比如药物偶联的抗体、裸抗和总抗体等需要使用不同的方法进行分析。本文总结了在ADC药物分析方法开发中遇到的较为常见的技术问题并提供相关的解决方案,以期为相关的分析方法开发提供参考,促进ADC药物安全有效地开发。

G蛋白偶联受体配体结合分析技术

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)是迄今发现的最大的多药物靶点的受体超家族,其激动剂或拮抗剂常被用于治疗各种疾病,在药物研发中扮演重要角色。测定配体与受体亲和力的结合实验是药物评价、研发和作用机理研究中不可缺少的部分。用于研究GPCRs与其配体结合的分析技术,可以按照标记方式的异同分为三类:同位素标记法、非同位素标记法和非标记法。非同位素标记法多采用荧光配体标记,利用竞争法或荧光共振能量转移直接获知结合情况;非标记法中利用各种生物传感器,通过检测配体结合受体后胞内分子运动引起的电信号或光信号的变化来表征结合情况。此外,质谱也已被用于受体-配体平衡解离常数的测定,显示了其在非标记结合分析及受体功能研究中的潜力。本文归纳了目前用于GPCRs结合分析的主要技术,对其原理及优缺点进行了综述,并对受体-配体结合分析中新方法的应用进行了展望。

基于配体结合分析-液相色谱串联质谱技术的生物技术药物定量分析方法研究进展

随着生物技术的发展,蛋白多肽类药物日益增多,对此类药物的定量检测及药代动力学研究变得越来越重要。传统生物技术药物分析方法主要是以配体结合分析(ligand-binding assay,LBA)为主,而液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术由于兼具色谱的高分离能力和质谱的高选择性等优点,也已成为生物大分子药物定量分析的有力手段。综合上述2种方法的各自优势,LCMS/MS技术联用LBA技术进行样品前处理,不仅能降低背景的复杂性,还能避免交叉反应,可以大大提高方法的选择性和灵敏度。另外,使用肽水平的免疫捕获可进一步提高分析灵敏度。联合使用配体结合分析-液相色谱串联质谱(hybird LBA with LC-MS/MS,LBA-LC-MS/MS)技术的关键影响因素包括(:1)捕获试剂的亲和力;(2)酶切位点和效率;(3)指纹肽的选择;(4)内标的选择;(5)蛋白质和肽段的纯化;(6)色谱分离;(7)质谱条件的优化。本文综述了近年来研究蛋白多肽类药物药代动力学的各种分析方法,其中LC-MS/MS和毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)-MS联用技术可望成为药代动力学研究中较有前途的分析方法。

川芎嗪对VEGF受体与其放射性配体结合的抑制

目的探讨川芎嗪对VEGF受体与其放射性配体结合的影响。方法采用血清药理学方法,分别制备川芎嗪大剂量、小剂量、阳性对照组鱼精蛋白、生理盐水各组含药血清,采用反相高效液相色谱法测定川芎嗪含药血清中药物浓度。将各组血清作用于人脐静脉内皮细胞ECV304,采用放射配体受体结合分析法(RBA)观察川芎嗪对VEGF受体最大结合容量(Bmax)和解离常数(Kd值)的影响。结果川芎嗪大剂量组Kd=343.30±36.64pmol·L-1,Bmax=46.26±5.85fmol/2×105cells,与生理盐水组相比Kd增大(P<0.05),Bmax减小(P<0.05)。川芎嗪小剂量组与生理盐水组相比Kd有增大趋势、Bmax有减小趋势,但差异无显著性。阳性对照组Kd=179.07±25.65pmol·L-1,受体最大结合容量Bmax=38.65±9.83fmol/2×105cells,与生理盐水组相比Kd差异无显著性(P>0.05),Bmax减小(P<0.05)。结论在川芎嗪作用下VEGF受体与125IVEGF结合的亲和力下降,VEGF受体数目下降,川芎嗪抑制VEGF受体与125IVEGF结合。川芎嗪含药血清(143.0mg·kg-1组)抑制VEGF受体与125IVEGF结合。

梗阻性黄疸大鼠肝脏GHR最大结合容量及结合力的改变

目的 研究梗阻性黄疸大鼠肝脏生长激素受体 (GHR)表达及结合力的改变。方法 采用受体放射配体结合分析(RBA)技术检测肝脏GHR的最大结合容量和解离常数 ,并与血清总胆红素、前白蛋白、肿瘤坏死因子 α作相关分析。结果 梗阻性黄疸大鼠肝脏GHR最大结合容量 (Bmax)明显下降 ,解离常数 (kd)明显增加。Bmax值与血清前白蛋白水平呈正相关 ,与血清总胆红素、肝组织匀浆肿瘤坏死因子 α水平呈明显负相关 ;而kd 值与血清前白蛋白呈负相关 ,与血清总胆红素、肝组织匀浆肿瘤坏死因子 α水平呈明显正相关。结论 梗阻性黄疸大鼠GHR的最大结合容量和结合能力均明显降低 ,可能与梗阻时TNF α等炎症因子的高表达、肝细胞胆盐蓄积等有关。GHR容量和结合能力的降低 ,可显著下调肝脏蛋白合成 ,并且可加重肠粘膜屏障的损伤 ,促进内毒素的吸收、TNF α等炎症因子的释放。因此GHR的最大结合容量及结合力的降低是梗阻性黄疸时病理生理改变的重要环节。

结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶与底物及其类似物的结合比较

目的建立重组结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶(MetRS)的制备方法,分析底物及其类似物与重组蛋白的结合能力。方法将结核分枝杆菌MetRS(MtMetRS)基因置于不同启动子调控之下。通过表达筛选选择重组蛋白大量制备的条件,使用分子筛制备重组蛋白,并验证其分子量。使用Thermal Shift Assay比较MetRS底物及其类似物与重组结核分枝杆菌MetRS的结合能力。结果通过不同重组质粒的表达筛选,确定重组蛋白制备方法。Thermal Shift Assay分析提示甲硫基腺苷酸(methionyl-adenylate,MetAde)与焦磷酸同时存在时可以提高重组蛋白的热稳定性。结论成功制备出具有天然活性的重组MtMetRS蛋白;应以甲硫基腺苷酸和焦磷酸分子结构为方向,设计、筛选结核分枝杆菌MetRS抑制剂。

大鼠肝脏、卵巢及肾上腺胰岛素受体结合性质的比较

目的比较大鼠肝脏、卵巢和肾上腺胰岛素受体（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＩＲ）的结合性质。方法放射配体结合分析法对ＩＲ的数目（用结合容量表示）与亲和力（用饱和常数表示）进行检测。结果大鼠肝脏、卵巢和肾上腺ＩＲ高亲和位点的结合容量分别为７．３５９×１０个／ｍｇ白质、８．０２９×１０个／ｍｇ蛋白质和６．４４０×１０个／ｍｇ蛋白质，饱和常数分别为６．１４７×１０Ｍ－１、１．５２７×１０Ｍ－１、１．０１０×１０Ｍ－１；ＩＲ低亲和位点的结合容量分别为２．４０３×１０个／ｍｇ蛋白质、２．４０３×１０个／ｍｇ蛋白质和２．２５７×１０个／ｍｇ蛋白质，饱和常数分别为２．９２０×１０Ｍ－１、２．００８×１０Ｍ－１和０．４３３×１０Ｍ－１。结论卵巢和肾上腺也存在丰富的ＩＲ，其数量与肝脏的相似，而饱和常数小于肝脏的ＩＲ。提示胰岛素对卵巢和肾上腺可能有重要的调节作用。

普鲁泊福对GABA_A受体结合功能的影响

目的 :观察普鲁泊福对离体小鼠脑细胞膜GABAA 受体结合功能的影响。 方法 :采用放射配体受体结合分析法 ,测定普鲁泊福对小鼠脑细胞膜3 H GABA特异性结合以及GABAA 受体饱和曲线的影响。 结果 :特异性结合试验显示 ,与对照组相比 ,1 0～ 30 0 μmol/L浓度组的普鲁泊福明显增强3 H GABA与脑细胞膜GABAA 受体的特异性结合 ,并呈浓度依赖性 (P <0 .0 5 ) ,而浓度低于 1 0 μmol/L的普鲁泊福无明显增强作用 (P >0 .0 5 )。GABAA 受体饱和试验显示 ,普鲁泊福组 (1 0 μmol/L)的饱和曲线解离常数Kd2 值明显低于对照组 (P <0 .0 1 ) ,但 2组的Kd1 、Bmax1 及Bmax2 值相比无统计学差异 (P >0 .0 5 )。 结论 :临床相关浓度的普鲁泊福可显著增强内源性GABA与GABAA 受体的结合功能 ,其主要机制是通过提高GABA低亲和力结合位点的亲和性而起作用的。

CHO细胞表达人源μ型阿片受体及其活性分析

μ型阿片受体在阿片类药物镇痛与成瘾中发挥重要作用 .从人脑组织总RNA通过一次反转录和两次PCR法扩增获得 μ型阿片受体的cDNA ,将其克隆至pcDNA3 1 (+)中 ,转染CHO细胞后 ,筛选单克隆细胞株并制备膜受体 ,检测重组细胞株表达的 μ型阿片受体与特异性配体的结合能力 .通过饱和性结合和竞争性结合试验证实 ,重组细胞株表达的 μ型阿片受体与天然的 μ型阿片受体具有基本一致的生物学特性 。

激素难治性前列腺癌组织中雄激素受体蛋白表达的研究

背景与目的:近来有研究报道,在激素难治性前列腺癌(hormonerefractoryprostatecarcinoma,HRPC)中发现有雄激素受体(androgenreceptor,AR)基因扩增,并提出AR基因扩增可能是导致激素治疗失败的一个新的分子机制。本研究拟对前列腺癌在激素治疗前和治疗失败后的AR蛋白表达作定量测定,进一步探讨AR表达与HRPC发生的关系。方法:采用放射配体结合分析方法测定28例晚期前列腺癌患者在激素治疗前以及治疗失败后原发癌组织中的AR蛋白含量。结果:28例前列腺癌在治疗前、后癌组织中的AR蛋白平均水平分别为(390.0±204.1)和(690.4±444.0)fmol/mgProtein,两者间差异有显著性(P<0.001)。其中10例在治疗后12个月内复发,其AR蛋白平均水平在治疗前、后分别为(398.2±199.5)和(448.2±274.1)fmol/mgProtein两者间差异无显著性(P>0.20),其余18例的AR蛋白平均水平在治疗前、后分别为(386.4±212.3)和(824.9±468.6)fmol/mgProtein,两者间差异有显著性(P<0.001)。结论:AR蛋白水平升高可能是前列腺癌对激素治疗不敏感的原因之一。

糖皮质激素受体水平在白血病、肾病治疗中临床意义的探讨

目的:探讨糖皮质激素受体(GCR)水平高低对急性淋巴性白血病(ALL)、肾病综合征(NS)疗效的影响。方法:采用受体放射配体结合技术测定ALL、NS和对照组外周血淋巴细胞糖皮质激素高亲和力受体GCRH和低亲和力受体GCRL位点数,分析GCR与疗效之间的关系;并通过动物实验观察中药小柴胡汤对应用糖皮质激素所产生的GCR“降调节”效应的影响。结果:疗前GCRH>4000位点/细胞的ALL患者对激素联合化疗疗效好,化疗后GCRH明显降调,但GCRL治疗前后无明显变化。NS患者疗前GCRH>6000位点/细胞,则对GC疗效好,当GCRH<3000位点/细胞,则GC治疗无效。SD大白鼠实验表明,小柴胡汤具有显著的调控GCR水平作用。结论:对ALL患者和NS患者治疗前检测GCR水平,有助于制定个体化的治疗措施。

动脉中的雌激素受体与一氧化氮合酶活性的关系

目的 :探讨动脉壁中雌激素受体在雌激素调控一氧化氮合酶 (NOS)活性中的作用。方法 :用放射配体结合分析技术检测大鼠主动脉中雌激素受体的含量。离体主动脉条药物孵育法观察雌激素和受体拮抗剂tamoxifen对NOS活性的影响。结果 :1 雌性大鼠主动脉中存在雌激素受体。 2 1nmol17β 雌二醇作用 8h能使大鼠主动脉NOS的活性显著增强 (P <0 0 1)。 3 雌激素受体拮抗剂tamoxifen能显著抑制雌激素的上述作用 (P <0 0 1)。结论 :17β 雌二醇对血管NOS活性的影响由动脉壁中雌激素受体介导 ,该作用可能是雌激素降低血管阻力、抑制动脉粥样硬化作用的重要机理之一。

利用国产^(125)碘源制备^(125)I-心得静及实验考核

用国产Na^(125)I源、氯胺-T法、制备(-)^(125)I心得静标记配体【(-)^(125)I-IPIN】,放射色谱法分离复合物,测得(-)_(125)I-IPIN的Rf值为0.35,比活度为46.12～55.32TBq/mmol,标记率为37％,放射化学纯度达95％以上,该标记配体与小鼠脑细胞膜β受体的结合用受体的放射配体结合分析法(RBA)考核,呈典型的饱和曲线,Scatchard分析呈一直线,平衡解离常数(Kd)为0.041±0.001nM,Hill系数接近于1(0.99)。

大肠癌雄激素受体表达的临床病理研究

目的 探讨大肠癌组织、癌周粘膜组织及外周血白细胞雄激素受体(AB)的含量与大肠癌发生发展的关系。方法 应用放射配体结合分析法(RBA)测定38例行手术切除的大肠癌组织、癌周粘膜组织及外周血白细胞雄激素受体的含量;同时用放射免疫法(RIA)测定大肠癌患者及正常人血浆雄激素(睾酮T)的水平,结合临床病理资料进行统计分析。结果 癌组织与癌周粘膜组织相比,AR含量明显升高,结肠癌组织蛋白AR:56±10pmol/g^(-1);直肠癌组织AR蛋白:57±12pmol/g^(-1);结肠癌和直肠癌周粘膜组织AR蛋白分别为34±10pmol/g^(-1)和27±12pmol/g^(-1))(P<0.01);高分化的癌组织蛋白AR含量(63±8pmol/g^(-1))明显高于低分化者(38±4pmol/g^(-1)(P<0.01);大肠癌患者血浆睾酮水平轻度增加;但白细胞AR表达:男(1186±127)位点·细胞^(-1);女(894±109)位点·细胞^(-1)明显高于正常对照组男(785±112)位点·细胞^(-1);女(697±105)位点·细胞^(-1)(P<0.01)。结论 大肠癌的发生可能与癌组织AR含量升高有关,AR含量与肿瘤的分化程度存在相关性。