指数富集的配基系统进化技术及其在血管研究中的应用

指数富集的配基系统进化技术是一种生物文库技术，它利用人工合成的、容量约为10^14-10^15的随机寡核苷酸文库与靶物质结合，经过多轮筛选获得靶物质的DNA或RNA适配子，具有实用范围广、筛选过程简便、适配子有高特异性和高亲和性等特点。在血管研究方面主要是针对血管内膜增生和新生血管形成开展的，在该领域发展潜力巨大。

氨基甲酸酯类农药适体筛选技术的建立

体外构建1个长度为91个核苷酸、内含30个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,运用指数富集的配基系统进化技术(SELEX),以氨基甲酸酯类农药的混合药剂作为靶分子,基于核酸分子与靶分子结合时构象会发生改变的原理,分离与靶分子结合的适体,并利用碱裂解法制备ssDNA次级文库。此方法优点在于不需要对农药小分子进行改造。经过9轮循环筛选,对氨基甲酸酯类混合农药的筛选效率从0.70上升到13.32,获得了有特异性的适体。本研究建立了一种非改造型农药小分子适体筛选的新方法,为农药残留快速检测提供条件。

核酸适体的筛选及其在养殖动物病原检测中的应用进展

动物疫病的暴发不仅造成了巨大损失,也严重阻碍着人工养殖业的健康可持续发展,因此亟须针对疫病病原开发快速检测技术和病原防控技术来预防病害的暴发。核酸适体(aptamer)是针对特定靶标,利用指数富集配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到具有高亲和力和高特异性的功能性单链寡核苷酸。本文结合国内外研究,阐述了核酸适体的优势以及其在人工养殖动物病原微生物防控中的研究进展,同时重点讨论了核酸适体在应用方面的5种挑战,(1)核酸适体筛选技术的局限性;(2)核酸适体在治疗方面缺乏稳定性与安全性;(3)核酸适体在生物体内如何持续性发挥靶向治疗作用;(4)核酸适体在活体实验中的精确性有待提高;(5)核酸适体与其他检测方法能否串联,从而构建全面性的检测平台。目前核酸适体针对养殖动物病原领域的研究只是刚刚起步,在快速检测与靶向治疗方面具有广阔的应用前景。

应用双向热循环消减SELEX技术筛选胃癌血清核酸适配体

胃癌是发病率及死亡率均较高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。血清肿瘤标志物的检测对提高早期胃癌的检出率,改善胃癌的治疗有重要的意义。核酸适配体以其灵敏度高、靶向性强等优势显示出了较强的临床适用性。本研究以双向热循环消减指数富集式配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术为支持,纳米(琼脂)磁珠材料为载体,胃癌血清及正常人血清为筛选靶标,结合高通量测序技术建立了快速高效的核酸适配体筛选方法。经过19轮双向筛选,获得高重复率的胃癌血清特异性核酸适配体序列10条及正常人血清特异性核酸适配体序列8条。将这些序列分别混合并制成检测试剂A、B,结合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术,对100份临床血清样本进行特异性验证。通过比较分析,建立了快速高效的胃癌血清检测技术。结果显示,核酸适配体G-AP1与N-AP1的二级结构类似于抗体的“Y”型,且呈茎环状。检测试剂A、B对胃癌及正常人血清的检出率分别为92%和88%。表明本技术可以较准确地筛选得到高特异性和强亲和力的核酸适配体,体现了核酸适配体作为新型肿瘤标志物在临床检测及治疗的应用潜力。

利用SELEX技术筛选小檗碱核酸适配体及其亲和力表征

小檗碱是一种价格低廉且生物安全性良好的小分子化合物,筛选能与小檗碱互相作用的核酸片段,旨在开发新型遗传元件并拓展其在生物技术领域的应用。利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX),经8轮实验从随机单链DNA文库中筛选出4条能与小檗碱高度特异性结合的核酸适配体。对其中两条重现性较好的适配体进行结构模拟分析表明,适配体序列富含鸟嘌呤和胞嘧啶且多形成茎环及G-四链体结构。亲和力测定结果显示,其中的2条核酸适配体与小檗碱作用的解离常数Kd都处于nmol级,表现出较高的亲和力,适配体S1的Kd值最小,仅为523 nmol/L,与小檗碱亲和力最大。

小分子靶标核酸适配体研究进展

核酸适配体是能够与靶分子高亲和力、高特异性结合的单链寡核苷酸。目前,在生物传感、疾病诊断和治疗等方面,以核酸适配体作为分子识别元件已经开发了许多具有应用可行性的各种检测方法。尽管核酸适配体具有这些方面的应用可能性,但是目前能够结合小分子的核酸适配体非常少。小分子具有多种多样的生物功能以及临床、商业价值,因此针对小分子靶标展开研究,开发新型、实用的分子识别探针用于检测这些小分子具有重要的研究意义。作者主要介绍了针对小分子靶标核酸适配体开发所面临的技术挑战,以及在生物传感和食品安全应用方面所存在的机遇。

赭曲霉毒素A核酸适配体筛选

目的筛选小麦和其他相关食品中常见的赭曲霉毒素A真菌毒素核酸适配体。方法采用固态靶标筛选策略和磁分离的筛选方法筛选赭曲霉毒素A的核酸适配体。结果获得的赭曲霉毒素A核酸适配体亲和力较高,解离常数为纳摩尔级;特异性好,与赭曲霉毒素A结构相似性化合物如赭曲霉毒素B、N-乙酰苯丙氨酸或华法令不结合或结合力非常弱。结论本文采用固态靶标筛选策略和磁分离的SELEX筛选方法获得了赭曲霉毒素A的高特异性、高亲和力核酸适配体,有望在农产品质量安全领域替代传统抗体开发真菌毒素快速检测传感器或制备固相亲和柱。

核酸适配体—靶标复合物解离常数测定方法研究进展

核酸适配体是通过体外指数富集配基系统进化技术筛选到的一小段单链DNA或RNA寡核苷酸片段,能够与靶标高亲和力、高选择性地结合。为了在实际检测中应用核酸适配体,必须深入了解核酸适配体—靶标的结合过程,如测定复合物的解离常数。本文综述了近年来有关核酸适配体—靶标复合物解离常数测定的方法。这些方法大致上分为两大类:一类是基于分离策略的测定方法,如透析法、超滤法、凝胶电泳法、毛细管电泳法和高效液相色谱法;另一类是基于均相策略的测定方法,如荧光强度法、荧光各向异性法、紫外可见分光光度法、圆二色谱法以及表面等离子体共振法等。本文对每种方法的原理、应用范围和特性进行了概括和比较,并对未来的发展趋势进行了展望。

核酸适配体及其应用研究进展

1990年Tuerk等1]报道了一种新的寡核苷酸筛选技术。该技术与PCR扩增相结合,在体外人工构建的短链核苷酸文库中筛选出能与噬菌体T4DNA聚合酶特异性结合的RNA配体。其原理基于生物自然进化机制,即:变异、选择和复制,故被命名为指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术,筛选出的短链DNA或RNA配体称为适配体。

随机ssDNA文库不对称PCR扩增条件的优化及回收效率比较

本研究开展了SELEX技术中ssDNA文库不对称PCR扩增及回收条件的优化试验,结果得出:20μL不对称PCR反应体系中上下游引物的最佳比例为60∶1,最优循环数为30个循环,回收效率最高的方法为乙醇沉淀法。此条件下,随机ssDNA文库不对称PCR扩增出来的条带清晰、稳定、特异性高,并具有较好的纯化效率。

幽门螺杆菌ssDNA适配子的筛选及其应用

目的通过富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选出与幽门螺杆菌(HP)菌体具有高亲和性适配子,并且利用其检测组织和活体内HP的感染。方法培养HP细菌,利用SELEX筛选获得HP菌体的适配子。在HP感染患者活检组织验证其结合。结果从第6轮筛选所得ssDNA中筛选出一条高结合力的适配子命名为HP1,将适配子HP1区别于其他筛选出的适配子,并检测其与幽门螺旋杆菌的亲和力。结论初步获得了针对HP菌体筛选出高亲和性适配子,为开发HP诊断试剂奠定了基础。

靶向肝癌细胞HepG2和SMMC-7721核酸适配体的筛选及鉴定

目的 以人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721作为混合靶标筛选获得特异性核酸适配体并对其进行鉴定。方法 以HepG2和SMMC-7721两种人源肝癌细胞为筛选混合靶标,利用细胞指数富集的配基系统进化(Cell-SELEX)技术筛选获得核酸适配体。利用流式细胞术检测文库富集情况,将富集文库进行克隆、测序,应用RNA structure、MEME在线软件进行序列分析,再次通过流式细胞术鉴定核酸适配体与靶标的结合能力及特异性。结果 通过10轮Cell-SELEX筛选得到核酸适配体10-8,流式细胞术检测显示核酸适配体10-8与人源肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞结合,且特异性靶向肝癌细胞。结论 筛选获得与人源肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721双靶标特异性结合的核酸适配体10-8。

分子水平毒理学在疾病控制中的应用

毒理学是生命科学中的重要分支之一,随着分子生物学的发展、分子毒理学也得到了迅速发展。目前分子生物学技术运用在毒理学主要有微小RNA技术在肿瘤及其他疾病诊断与治疗的应用;脱氧核糖核酸芯片技术在基因突变快速检测,病毒基因表达特点等疾病的预防、检测及治疗方面的应用;指数富集的配基系统进化技术在基因诊断、治疗及毒素检测等疾病控制方面的应用;以及印迹技术、原位杂交技术、免疫组织化学、基因剔除等技术。

适配子对人类免疫缺陷病毒的抑制作用

人类免疫缺陷病毒在机体细胞内不断复制并发生变异,以拮抗外界环境发生的变化。尽管高效抗逆转录病毒治疗方案(HAART)在治疗艾滋病方面取得了较大进展,但该疗法服用方法复杂、副作用较大及药物价格昂贵,因此仍需要开发新的方法来治疗HIV-1感染。最近备受关注的是适配子为基础的疗法。适配子具有特异性高、靶标单一和通用性等特点,可将其用于治疗多种疾病。在本文中,我们将介绍核酸适配子抗HIV-1作用的研究进展,并讨论抗HIV-1核酸适配子的应用前景及面临的挑战,为开发新的抗HIV-1药物提供理论支持。

全细胞的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体（aptamer）是从人工合成的随机单链DNA（ssDNA）或RNA文库中筛选得到的,能够高亲和力、高特异性地与靶标结合的ssDNA或RNA。核酸适配体的靶标范围广,可包括小分子、蛋白质、细胞、微生物等多种靶标。其中以细胞为靶标的适配体在生物感应、分子成像、医学诊断、药物传输和疾病治疗等领域有很大的应用潜能。但全细胞的核酸适配体筛选过程复杂,筛选难度大,筛选的适配体性能不佳是导致目前可用的适配体非常有限的主要原因。由于细胞表面蛋白质在提取纯化过程中分子结构和形态会发生改变,故以膜表面蛋白质为靶标筛选的适配体很难应用于识别整体细胞。以全细胞为靶标的核酸适配体筛选则不需要准确了解细胞表面的分子结构,筛选过程中可保持细胞的天然状态,以全细胞为靶标筛选出的核酸适配体有望直接用于全细胞识别。本文总结了2008~2015年全细胞的核酸适配体筛选的研究进展,介绍了靶细胞的分类、核酸库的设计、筛选条件和方法以及核酸适配体的亲和力表征方法等。并列出全细胞靶标的核酸适配体序列。

适配体在食品中有害小分子检测领域应用的研究进展

适配体是与靶标具有高亲和力及选择性结合能力的单链寡核苷酸,可通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)筛选得到。SELEX技术可选择的靶分子范围十分广泛,包含蛋白质、多肽、核苷酸、染料、氨基酸、金属离子、生物毒素等;经SELEX技术筛选出的适配体具有特异性强的特点;同时该技术具有周期短的优点;筛选用的文库化学合成即可,避免了动物实验。食品中有害小分子主要包括真菌毒素、农药、兽药、金属子、违禁添加物等,主要存在于粮食、谷物、饲料、各类食品、水中。这些有害小分子通过食物链进入人及动物体内,严重威胁到其健康。目前已有不少文献报道了以适配体作为识别元件,用于食品安全、环境检测及生物医药等领域的多种高亲和力及特异性的传感器和检测方法的建立。本文主要介绍了近年小分子适配体在食品安全检测中应用的研究进展。

细胞特异性核酸适配体筛选新策略的研究进展

核酸适配体(aptamer)是在体外采用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列(RNA 或DNA),能折叠成特定的三维空间结构同靶物质进行高特异性与高亲和性的结合。近年来,以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)获得的核酸适配体在疾病相关的领域有很大的应用潜力,尤其在细胞分子的识别、生物标志物的发现等方面,但cell-SELEX 的过程复杂、难度大及获得的核酸适配体性能不佳等问题仍然制约着细胞特异性核酸适配体的进一步发展,如何高效地筛选获得核酸适配体是其应用的关键。本文总结了目前在cell-SELEX技术基础上发展起来的新方法、新策略及核酸适配体在肿瘤研究中的应用,望为相关科研人员的研究提供参考。

灭活铜绿假单胞菌适体的筛选

利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以灭活的铜绿假单胞菌为靶标,从体外合成的96 nt随机ssDNA文库中筛选与铜绿假单胞菌特异结合的适体.在第12轮和第14轮与其它假单胞菌属进行反筛策略,并进行了适体的结合亲和力的测定,再分别利用ClustalX、Mega2和Mfold sever软件分析适体的一级和二级结构.研究结果表明,经过15轮筛选,随机ssDNA文库与铜绿假单胞菌结合的A值从0.022上升到0.448.反筛与未反筛的结合A比值最高比为53倍.经过第15轮反筛后的24个阳性克隆子测序,根据软件分析,其可分成10个家族.每个家族都有其共同的保守序列(除第10个家族),其中有2条序列几乎完全一致(F23和F47),同源性达到97%,A值分别高达1.598和1.508,Kd为14.55和77.46 nmol/L,间接说明适体与铜绿假单胞菌的结合力明显增高.

人FcγRI特异性核酸适配体的体外筛选及鉴定

人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术——从体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选人FcγRI的高亲和力和高特异性的核酸适配体(aptamer)。本文以人FcγRI为靶标,将其固定在羧基活化磁珠上,进行SELEX筛选。经过8轮筛选,共获得3个重点研究的单克隆适配体。生物信息学分析结果显示,人FcγRI适配体的模拟二级结构以茎-环和G-四聚体为主,可能是FcγRI与适配体的作用位点,G-T错配常见。流式细胞计量术和荧光显微镜分析显示,筛选出的典型单克隆适配体解离常数(the dissociation constant,Kd)均达到纳摩尔水平,而且适配体只与脓毒血症中性粒细胞结合,具有良好的亲和力和特异性。本研究表明,通过SELEX技术,成功获取了人FcγRI特异性核酸适配体,为以此适配体为分子探针,进一步建立用于脓毒血症早期诊断的新方法奠定了基础。

泡沫细胞靶向适配子的体外筛选

目的筛选巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子,为动脉粥样硬化的靶向治疗提供实验依据。方法以80 mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育THP-1巨噬细胞72 h,建立泡沫细胞模型;利用指数富集配基的系统进化技术,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选特异性寡核苷酸适配子;荧光显微镜观察寡核苷酸文库与泡沫细胞结合的特异性;克隆、测序确定适配子的序列并进行一级结构和二级结构分析。结果通过油红O染色和高效液相色谱分析,确定成功建立泡沫细胞模型;经过18轮的循环筛选,寡核苷酸文库仅与泡沫细胞结合,不再结合巨噬细胞、血管平滑肌细胞。测序鉴定出的所有适配子序列可以分为12个家族,没有共同的同源序列。二级结构分析表明,适配子主要形成茎环结构,这可能是适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的结构基础。结论利用复合靶指数富集配基的系统进化技术成功筛选出巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子。