巨型艾美耳球虫配子体蛋白EmGAM56的原核表达及其抗原性鉴定

本研究将巨型艾美耳球虫Emgam56基因去除信号肽后的ORF序列连接至pET-28a(+)载体,构建表达载体pET-28-Emgam56,转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达;分析表达产物的可溶性和重组蛋白的分子相对质量,并进一步鉴定重组配子体蛋白rEmGAM56的抗原性。SDS-PAGE分析表明,表达载体能表达56000左右蛋白质,主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blot检测表明,rEmGAM56蛋白能被鼠抗rEmGam56多克隆抗体和巨型艾美耳球虫感染鸡的康复血清特异性识别,显示重组蛋白具有良好的抗原性。本研究结果为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定了基础。

毒害艾美耳球虫重组配子体蛋白rEnGAM22与rEnGAM59联合免疫对鸡的保护效果观察

为了探讨毒害艾美耳球虫重组配子体蛋白rEnGAM22与rEnGAM59联合免疫的保护效果,将rEnGAM22与rEnGAM59按体积比1∶1混匀,加弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂后免疫雏鸡,以排出血便数、平均增重、相对增重率、存活率、病变记分、卵囊减少率和血清抗体水平等为指标评价保护效果,同时设rEnGAM22、rEnGAM59单免组、未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组为对照。结果显示,成活率均为100%,免疫组的血便数均少于未免疫攻虫组;除rEnGAM22单免疫组外,其余各免疫组的平均增重均显著大于未免疫攻虫组(P<0.05),且与未免疫未攻虫组相比差异不显著(P>0.05);联合免疫低剂量组的相对增重率最高(97.02%),卵囊减少率与联合免疫高剂量组的相近,分别为41.93%和41.87%,高于单免疫组;联合免疫组的病变记分显著低于未免疫攻虫组(P<0.05),血清抗体水平显著高于单免疫组(P<0.05)。结论:rEnGAM22与rEnGAM59联合免疫的保护效果要好于单免,对毒害艾美耳球虫有一定的免疫保护作用。

柔嫩艾美耳球虫3种重组配子体蛋白免疫雏鸡的抗球虫免疫保护效果

将柔嫩艾美耳球虫重组配子体蛋白rEtGAM22、rEtGAM56和rEtGAM59分别单独免疫(单免)或联合免疫(联免)雏鸡,同时设未免疫攻虫组和空白对照组为对照,分别用柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫进行攻虫试验,以存活率、排出血便数、平均增重、相对增重率、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数和血清特异性抗体水平为指标来评价这3种重组蛋白免疫雏鸡的抗球虫免疫保护效果。结果显示:各试验组的成活率均为100%。与空白对照组比较,各免疫组鸡排血便堆数减少、平均增重显著(P<0.05)增加;用柔嫩艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM22与rEtGAM59联免组相对增重率(86.71%)最高,rEtGAM59单免组平均病变记分最低、卵囊减少率(59.61%)最高,rEtGAM22与rEtGAM59联免组抗球虫指数值(163.71)最高。用毒害艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM22与rEtGAM59联免组相对增重率(83.06%)最高,rEtGAM56与rEtGAM59联免组平均病变记分最低,rEtGAM56单免组卵囊减少率(66.97%)最高,rEtGAM56与rEtGAM59联免组抗球虫指数(158.23)最高。各免疫组血清特异性抗体水平均显著(P<0.05)高于空白对照组,其中rEtGAM56单免组血清特异性抗体水平最高,且显著(P<0.05)高于其他免疫组。结论:rEtGAM59单免或与rEtGAM22联免的抗柔嫩艾美耳球虫的保护效果较好,rEtGAM56单免或与rEtGAM59联免的抗毒害艾美耳球虫的保护效果较好。

毒害艾美耳球虫配子体抗原EnGAM22单克隆抗体的制备与鉴定

旨在制备毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)配子体抗原EnGAM22单克隆抗体,用Ni-NTA亲和层析纯化的重组抗原rEnGAM22免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用预先建立的ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行4次亚克隆后,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株并命名为2F3和3D3;对单抗亚类和特异性进行鉴定,应用单抗识别天然蛋白和虫体定位。结果显示,单克隆抗体2F3和3D3亚类分别为IgG2a、IgG2b,纯化后腹水效价分别为1∶256000、1∶64000,能特异性识别重组抗原rEnGAM22和毒害艾美耳球虫天然配子体蛋白;免疫荧光定位显示单克隆抗体2F3和3D3能特异性识别大配子体的成壁体和卵囊壁,表明EnGAM22抗原参与卵囊壁的形成。制备的单克隆抗体为研究球虫卵囊壁形成的分子机制奠定了基础。