利用CRISPR/Cas9双元转基因体系探究家蚕配子生成素结合蛋白基因Bmggnbp2的功能

【目的】配子生成素结合蛋白2(gametogenetin binding protein 2,ggnbp2)在哺乳动物配子发生等生殖相关过程中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为模型,探究驯化基因ggnbp2的生物学功能,为鳞翅目昆虫中该基因的深入研究提供线索。【方法】在NCBI GenBank数据库通过序列比对检索到翅目昆虫ggnbp2基因的序列;通过贝叶斯法构建系统发育树进行ggnbp2基因的系统发育分析。根据我们前期研究建立的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对家蚕中Bmggnbp2进行选择信号分析;利用已发表的基因芯片数据分析Bmggnbp2在家蚕5龄第3天幼虫中的组织表达特征。利用CRISPR/Cas9双元转基因体系构建Bmggnbp2敲除突变体,测定分析突变体与对照品系Nos-Cas9在繁殖性状(单雌产卵量和卵孵化率)以及与对照品系U6-Bmggnbp2 sgRNA和Nos-Cas9经济性状(全茧重、蛹重和茧壳重)的差异。【结果】ggnbp2在鳞翅目昆虫中广泛存在,且高度保守,并且在家蚕中具有强烈的人工选择信号。Bmggnbp2在家蚕5龄第3天幼虫的脑、卵巢、精巢和丝腺中均高度表达。利用CRISPR/Cas9双元转基因体系成功获取家蚕Bmggnbp2基因的嵌合体敲除突变体△Bmggnbp 2。与对照Nos-Cas9精巢的典型肾形不同,突变体△Bmggnbp 2的精巢呈椭圆形,并且表面出现一层较厚的黄色覆盖物,但突变体△Bmggnbp 2单雌产卵量和卵孵化率与对照品系Nos-Cas9以及全茧重、蛹重和茧壳重与对照U6-Bmggnbp2 sgRNA和Nos-Cas9均没有显著差异。【结论】GGNBP2在鳞翅目昆虫中对繁殖的影响可能并没有在哺乳动物中那么至关重要,其具体的作用机制仍需要进一步探讨。

微小RNA-494-3p靶向配子生成素结合蛋白2促进结直肠癌细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的实验研究

目的研究微小RNA-494-3p(miR-494-3p)影响结直肠癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化(EMT)的分子机制。方法于2019年1—12月体外培养购自美国ATCC的结直肠上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系T84、LS1034和HCT116,实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞中miR-494-3p和配子生成素结合蛋白2(GGNBP2)mRNA的表达量,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中GGNBP2蛋白表达。将LS1034细胞分为对照(NC)组、miR-494-3p抑制剂(anti-miR-494-3p)组、抑制剂阴性对照(anti-miR-con)组、GGNBP2过表达载体(pcDNA-GGNBP2)组、空载体(pcDNA-con)组、anti-miR-494-3p+GGNBP2小干扰RNA(si-GGNBP2)组和anti-miR-494-3p+小干扰RNA阴性对照(si-con)组,甲基噻唑基四唑(MTT)法测定LS1034细胞存活率,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测相关蛋白细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达。双荧光素酶报告系统验证miR-494-3p和GGNBP2的调控关系。结果与NCM460细胞相比,结直肠癌细胞T84、LS1034和HCT116中miR-494-3p表达量均显著升高[(1.91±0.11)、(2.23±0.14)、(2.08±0.12)比(1.00±0.04),P<0.001],GGNBP2 m RNA表达量均显著下降[(0.51±0.08)、(0.38±0.06)、(0.45±0.07)比(1.00±0.11),P<0.001],GGNBP2蛋白表达量均显著下降(P<0.001)。与anti-miR-con组相比,anti-miR-494-3p组LS1034细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著下降[(41.29±3.89)%比(84.36±7.28)%,(132.56±7.56)个比(246.3±10.64)个,(55.64±5.64)个比(145.62±9.56)个,均P<0.001],细胞中Cyclin D1、MMP-2、Vimentin蛋白表达量均显著下降,均P<0.001,E-cadherin蛋白表达升高、蛋白表达降低(P<0.001)。与pcDNA-con组相比,pcDNA-GGNBP2组LS1034细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著下降,P<0.05,细胞中Cyclin D1、MMP-2、Vimentin蛋白表达均下降,均P<0.001,E-cadherin蛋白表达升高,蛋白表达降低,P<0.001。miR-494-3p靶向负调控GGNBP2的表达。与anti-miR-494-3p+si-con组相比,anti-miR-494-3p+si-GGNBP2组LS1034细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著上升,细胞中Cyclin D1、MMP-2和Vimentin蛋白表达均升高,E-cadherin蛋白表达下降,均P<0.001。结论miR-494-3p通过靶向抑制GGNBP2促进结直肠癌LS1034细胞迁移、侵袭及EMT。

GGNBP1抗体制备及小鼠组织表达谱分析

体外实验研究表明配子生成素结合蛋白1(GGNBP1)可能与GGN1相互作用形成睾丸特异性复合物,在精子生成过程中发挥作用。从小鼠睾丸总RNA中反转录扩增Ggnbp1全长cDNA,构建表达质粒,在大肠杆菌中表达GGNBP1,经聚丙烯酰胺凝胶纯化后免疫新西兰白兔,制备兔多抗血清。镍离子金属螯合柱纯化表达的GGNBP1蛋白,与NHS活化基团交联,制备GGNBP1抗体亲和层析柱,纯化GGNBP1多抗。在293FT细胞中瞬时表达Myc-GGNBP1融合蛋白,用于Myc单抗验证GGNBP1抗体特异性,结果证明获得了特异性的GGNBP1抗体。分别制备小鼠脑、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、卵巢、睾丸和子宫组织匀浆,用GGNBP1抗体进行Western印迹分析,结果仅在睾丸组织匀浆中检测到GGNBP1特异性条带,证明GGNBP1是睾丸特异性表达蛋白。

GGNBP2与GGN在小鼠睾丸生精细胞定位及作用

目的探讨配子生成素结合蛋白2(GGNBP2)和配子生成素(GGN)在小鼠睾丸生殖过程中的细胞定位以及作用,初步阐明GGNBP2缺失引起睾丸生精功能障碍的机制。方法采用免疫沉淀方法检测GGNBP2与GGN相互作用;免疫荧光、免疫组化检测GGNBP2与GGN细胞定位;PCR检测野生型Ggnbp2基因敲除型小鼠睾丸生殖细胞GGN mRNA表达;Western blot检测其GGN蛋白表达。结果 GGNBP2与GGN相互作用,两种蛋白共同定位于精母细胞和精子细胞(Golgi phase,Cap phase)中的细胞核和胞浆,精子细胞(Acrosome phase,Maturation phases)中的顶体和尾部,GGNBP2缺失引起GGNmRNA水平和蛋白水平减低,在精母细胞中GGN定位改变。结论 Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷可能通过降低GGN表达,改变GGN细胞定位,DNA双链损伤修复机制受损。