大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基的克隆、表达、纯化及包涵体的复性

利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取酒石酸脱氢酶β亚基基因(TtdB),并将之克隆到质粒pUC18上,转化大肠杆菌DH5α细胞.经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和双波长扫描分析,确定酒石酸脱氢酶β亚基在大肠杆菌中表达时以包涵体形式存在.目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性.复性产率可达90%.

大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶β亚基体外分子交联

为证明高音等提出的蛋白质交联三步假说,通过PCR技术扩增大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶β亚基(L-tartrate dehydratase beta subunit,TtdB)野生型与Cys/Ser突变型目的基因,构建带6×His标签的诱导型表达载体pTrcHisC-TtdB。重组蛋白以包含体形式存在,应用TALON固定化金属亲和树脂(Immobilized metal affinity chromatography,IMAC)以变性的方法纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性,复性率可达70%。将复性后的两种蛋白通过热诱导去折叠和氧化重折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验。SDS-PAGE分析表明:野生型TtdB在其变性的临界温度反应时,出现交联二聚体和多聚体;在氧化重折叠后SDS-PAGE前加入100mmol/LDTT时,交联强度明显减弱。这种DTT打不开的交联即为异肽键交联;若在其氧化重折叠反应液中加入DTT则没有任何交联。突变型TtdB在与野生型TtdB相同的热诱导去折叠条件下,完全没有二聚体和多聚体的形成。这说明分子间二硫键的形成能促进随后分子间异肽键的形成。

突变型大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基基因的克隆表达与包涵体的复性

目的利用生物工程相关技术,获得不含Cys的突变型大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基,为下一步蛋白质交联奠定基础。方法利用PCR定点突变技术扩增目的基因,并将之克隆到质粒PGM-T,转化大肠杆菌DH5α。经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性。结果通过SDS-PAGE分析,确定目的蛋白以包涵体形式存在。复性产率可达70%。结论此次实验所得到的目的蛋白的纯度与活性均满足蛋白质交联的需要。