人酪氨酸激酶6原核表达载体的构建、表达、纯化与鉴定

目的构建人络氨酸激酶6(PTK6)与His融合蛋白重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。方法通过PCR在编码PTK6的cDNA序列两端添加EcoR I和BamH I酶切位点,双酶切后将编码PTK6的cDNA序列亚克隆至原核表达载体PHUE构建重组蛋白表达载体PHUE/PTK。重组载体经鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导重组蛋白表达。收集菌体裂解后,用尿素洗涤和溶解包涵体。溶解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化产物。结果成功构建人PTK6重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为55 000,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度大于80%的目的重组蛋白。结论人PTK6 His融合蛋白的纯化为多克隆及单克隆抗体的制备以及结构和功能的研究奠定了基础。

蛋白酪氨酸激酶6对TNF-α诱导的人气道上皮屏障功能减损的影响

目的:探讨蛋白酪氨酸激酶6(PTK6)对TNF-α诱导的人气道上皮屏障功能减损的影响及相关机制。方法:体外培养人气道上皮16HBE细胞,予TNF-α刺激,分别转染PTK6 siRNA和recombined PTK6,以转染Scramble siRNA和Empty vector为对照。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞活性;跨皮细胞组抗仪检测细胞跨皮细胞阻抗(TER);辣根过氧化物酶(HRP)流量法反应细胞通透性;RT-PCR检测ZO-1、Occludin mRNA水平;Western blot检测PTK6、ZO-1、Occludin、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化c-Jun氨基端激酶1/2(p-JNK1/2)和磷酸化p38(p-p38)蛋白水平。结果:TNF-α刺激后,细胞ZO-1、Occludin转录及蛋白水平、TER值显著降低,细胞通透性增高,同时PTK6、p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38蛋白水平显著增高(P<0.05);上调PTK6使ZO-1、Occludin转录及蛋白水平和TER值进一步降低,细胞通透性和p-JNK1/2、p-p38蛋白水平也进一步增高(P<0.05),但下调PTK6后上述指标呈相反变化(P<0.05);上调或下调PTK6对p-ERK1/2无明显影响。结论:下调PTK6可以降低JNK1/2、p38MAPK磷酸化水平,进而改善TNF-α诱导的气道上皮屏障功能减损。

微小RNA在恶性肿瘤中对蛋白酪氨酸激酶6调控作用的研究进展

蛋白酪氨酸激酶6(protein tyrosine kinase 6,PTK6)是一种非受体酪氨酸激酶,在各类肿瘤的发生发展中起关键作用,且在肿瘤中的作用具有双重性。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种调节转录后基因表达的小非编码RNA。近年来,越来越多的研究表明,miRNA对PTK6的调控作用在肿瘤中起重要作用。本文对在不同癌症中miRNA对PTK6表达的影响作一综述,以期为癌症治疗提供理论依据。

蛋白酪氨酸激酶6抑制剂的研究进展

蛋白酪氨酸激酶6(PTK 6)是一种细胞内的非受体型Src相关酪氨酸激酶。在对乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌和前列腺癌的研究中发现,PTK6可以诱导肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,PTK6在上述类型肿瘤的发展过程中发挥着重要作用,因此,抑制PTK6的活性可有效地控制肿瘤的发生发展。PTK6是一个非常有价值的潜在的癌症治疗靶点。本文主要对近年来关于PTK6抑制剂的研究进展做一综述。

酪氨酸蛋白激酶6与细胞外信号调节激酶信号通路在肿瘤发生发展中作用的研究进展

酪氨酸蛋白激酶6(protein tyrosine kinase 6,PTK6)是一种与Src家族密切相关的非受体酪氨酸激酶,能够促进多种生长因子受体的致癌信号通过下游信号分子,如细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)参与多种肿瘤的发生发展,发挥促癌或抑癌的作用。ERK信号通路被认为是经典的丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)信号转导途径,在细胞增殖与分化的调控中起重要作用。近年来研究表明,PTK6作为肿瘤的新靶点,可与下游ERK信号通路相互作用,从而调节肿瘤的发生发展。本文就PTK6影响肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等与ERK信号通路的相关性作一综述。

苦豆碱调节IL-6/JAK1/STAT3信号通路对结直肠癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的:探讨苦豆碱(ALO)调节IL-6/酪氨酸激酶1(JAK1)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路对结直肠癌(CRC)细胞行为的影响。方法:SW480分为CK组(正常培养的SW480细胞)、ALO低剂量组(ALO-L组,0.2 mmol/L)、ALO中剂量组(ALO-M组,0.4 mmol/L)、ALO高剂量组(ALO-H组,0.8 mmol/L)、ALO-H+激活剂(IL-6激活剂重组人IL-6蛋白)组(0.8 mmol/L+100 ng/ml)。CCK-8、平板克隆实验检测SW480细胞增殖;流式细胞术检测SW480细胞凋亡;Western blot检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、IL-6、p-JAK1、p-STAT3蛋白表达。将自然杀伤细胞NK-92MI分别与上述5组细胞共培养,并依次命名为CK共培养组、ALO-L共培养组、ALO-M共培养组、ALO-H共培养组、ALO-H+激活剂共培养组,检测共培养细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平及共培养体系中NK-92MI的免疫杀伤率。结果:与CK组相比,ALO-L组、ALO-M组、ALO-H组OD_(450)值、克隆形成率、PCNA、IL-6、p-JAK1、p-STAT3蛋白表达降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);与ALO-H组相比,ALO-H+激活剂组SW480细胞OD_(450)值、克隆形成率、PCNA、IL-6、p-JAK1、p-STAT3蛋白表达升高,细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低(P<0.05);ALO-L共培养组、ALO-M共培养组、ALO-H共培养组上清中TNF-α、IFN-γ水平、NK-92MI细胞免疫杀伤率高于CK共培养组,且呈剂量依赖性(P<0.05);与ALO-H共培养组相比,ALO-H+激活剂共培养组上清中TNF-α、IFN-γ水平、细胞免疫杀伤率降低(P<0.05)。结论:ALO可能通过抑制IL-6/JAK1/STAT3信号通路抑制SW480细胞增殖、免疫逃逸,促进细胞凋亡。

DOK6、TBC1D16联合检测对急性髓系白血病患者的化疗敏感性和预后的预测价值

目的探讨酪氨酸蛋白激酶6下游(DOK6)、TBC1D16联合检测对急性髓系白血病(AML)患者的化疗敏感性和预后的预测价值。方法纳入2015年4月至2018年4月淄博市第一医院收治的AML患者152例。化疗前采集患者骨髓和/或外周静脉血,分离单核细胞。实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测单核细胞中DOK6、TBC1D16的表达水平和甲基化水平,并比较不同表达水平AML患者化疗后完全缓解的比例。采用受试者工作特征曲线的曲线下面积分析DOK6、TBC1D16联合检测对急性髓系白血病患者的化疗敏感性的预测价值。结果相比于DOK6低表达,DOK6高表达的AML患者固有核型分类的不良风险更高、未完全缓解比例更低,差异有统计学意义(P<0.05);在TBC1D16低表达或高表达的AML患者中,相比于TBC1D16低表达,TBC1D16高表达的AML患者固有核型分类的不良风险更高、未完全缓解比例更低,差异有统计学意义(P<0.05)。完全缓解的AML患者具有更高的DOK6和TBC1D16表达水平、更高的TBC1D16甲基化表达水平和较低的DOK6甲基化表达水平(P<0.05)。DOK6高表达或DOK6低甲基化或TBC1D16高表达或TBC1D16低表达的AML患者的总生存期更低(P<0.05)。TBC1D16和DOK6同时高表达的AML患者的总生存期更低(P<0.05);TBC1D16高甲基化和DOK6低甲基化的AML患者的总生存期更低(P<0.05)。DOK6和TBC1D16单向检测对AML患者化疗敏感性预测的灵敏度分别为96.98%和98.32%、特异度分别为98.47%和97.59%。DOK6、TBC1616联合检测对AML化疗敏感性预测的灵敏度为97.10%,特异度为96.39%,准确性为96.71%。结论单核细胞中DOK6、TBC1D16的联合检测可作为AML患者化疗敏感性和预后的潜在预测因子。

食管鳞癌中PTK6的表达水平及其临床预后价值

目的探讨食管鳞癌中酪氨酸蛋白激酶非受体型6号蛋白(protein tyrosine kinase 6,PTK6)表达水平与其临床病理学因素、预后之间的关系。方法运用免疫组织化学方法检测210例食管鳞癌及配对的160例癌旁正常食管黏膜组织石蜡切片中PTK6蛋白表达水平。结果食管鳞癌与癌旁正常食管黏膜间PTK6表达水平存在统计学差异(P<0.001)。PTK6表达水平与食管鳞癌临床病理分级密切关联(P<0.001)。对比肿瘤中PTK6低表达组,PTK6高表达组有更好的临床预后。经Cox风险回归模型分析显示N分期及PTK6蛋白表达水平均是影响食管鳞癌患者预后的独立风险因素。结论 PTK6作为1种独立的预后影响因素,对于预测食管鳞癌根治术后患者临床预后有重要意义。

非受体酪氨酸激酶抑制剂CYT387对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡影响及作用机制

目的探讨非受体酪氨酸激酶(JAK)抑制剂CYT387对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖、凋亡的作用及其相关信号通路的关系。方法选取4株MM细胞株(RPMI-8226、LP-1、U266、XG-7)及北京积水潭医院自2012年3月至2015年3月收治的26例MM患者为研究对象。对26例MM患者的骨髓及肿瘤组织进行免疫组化磷酸化JAK2(p-JAK2)表达检测。采用蛋白免疫印迹法检测4株MM细胞株中JAK2的磷酸化水平。采用蛋白免疫印迹法对XG-7细胞株用不同浓度CYT387处理后的磷酸化信号转导及磷酸化STAT3(p-STAT3)进行检测。采用不同浓度CYT387处理4株MM细胞株和JAK2不同磷酸化水平的MM原代肿瘤细胞后,进行细胞活力检测。蛋白免疫印迹法检测相同浓度CYT387处理后LP-1细胞株在不同时间点B细胞淋巴瘤/白血病2(BCL2)、B细胞淋巴瘤-特大型(BCL-xL)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达状况。结果26例MM肿瘤组织中,13例(50%)呈p-JAK2阳性表达。4株细胞株全部p-JAK2阳性表达。随着CYT387浓度增加,XG-7和LP-1细胞株的p-STAT3的表达显著降低(P<0.05)。外源白细胞介素6(IL-6)的刺激可整体提高p-STAT3的表达,但并不能改变CTY387呈浓度依赖性显著降低p-STAT3表达的趋势(P<0.05)。4株MM细胞株和3例MM原代肿瘤细胞,随着CYT387浓度增加细胞活力均显著降低(P<0.05),p-JAK2阳性的原代MM细胞更为显著(P<0.05)。用相同浓度的CYT387处理LP-1细胞株后,检测caspase-3表达处于高水平,而BCL-xL、BCL2、PARP表达水平逐渐下降,具有时间依赖性(P<0.05)。结论CYT387可通过阻断MM细胞内IL-6/JAK/STAT信号通路抑制肿瘤增殖,同时可以引发凋亡相关蛋白活化诱导MM细胞凋亡。

安肠愈疡汤对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障的修复作用及机制研究

[目的]观察中药安肠愈疡汤对溃疡性结肠炎(UC)大鼠咬合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白1(Claudin-1)基因、蛋白及白细胞介素-13(IL-13)/酪氨酸激酶1(JAK1)/信号转导与转录激活因子6(STAT6)信号通路的调控作用,探讨其修复肠黏膜屏障的机制。[方法]将36只SD大鼠随机分为6组,分别为空白组、模型组、美沙拉嗪对照组、安肠愈疡汤低、中、高剂量组,经4.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液造模及药液灌胃后处死大鼠,留取标本,苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠结肠黏膜组织病理情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测结肠组织Occludin、Claudin-1基因、蛋白的表达,RT-PCR法检测IL-13、JAK1、STAT6基因的表达。[结果]各用药组均明显降低组织病理学评分,差异均具有统计学意义(P<0.01),镜下表现为结肠组织结构好转,炎细胞浸润减轻,均可上调Occludin、Claudin-1基因及蛋白表达(P<0.01),差异均具有统计学意义;除低剂量组外,余用药组不同程度激活IL-13/JAK1/STAT6通路的基因表达(P<0.05或P<0.01);以中药高剂量组和美沙拉嗪组的作用最为显著,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。相关性分析发现,Occludin、Claudin-1表达水平与JAK1、STAT6表达水平呈负相关(r=-0.664,r=-0.654,r=-0.629,r=-0.637,P<0.05),与IL-13表达水平呈正相关(r=0.888,r=0.983,P<0.05),差异均具有统计学意义。[结论]中药安肠愈疡汤能够明显促进UC大鼠肠黏膜修复,其作用机制可能与激活IL-13/JAK1/STAT6信号通路,上调Occludin和Claudin-1的表达水平有关。

唾液腺乳腺样分泌癌的研究进展

唾液腺乳腺样分泌癌(MASC)是一种近年来才被描述的唾液腺肿瘤新类型,因其存在与乳腺分泌性癌类似的特异性的E-二十六变异基因6-神经营养酪氨酸受体激酶3融合基因而得名。MASC在病理形态上非完全特异,与诸多唾液腺肿瘤有重叠,所以在病理诊断中经常将其诊断为腺泡细胞癌或黏液表皮样癌等。本文就MASC的临床表现、病理特点、分子生物学特征、鉴别诊断、预后和治疗等研究进展作一综述。

IL-8在人肺上皮细胞的MUC5B表达及调控通路

目的:在肺上皮细胞模型中探讨IL-8是否对MUC5B的转录和合成产生影响,并探讨其是否通过JAK2/STAT6信号通路调节黏蛋白MUC5B分泌。方法:(1)体外培养人肺上皮细胞(HBE135-E6E7),无血清培养24h后分为不同浓度组IL-8(20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、160ng/ml)、不同时间组(6h、12h、24h、48h),用ELISA测得各组MUC5B蛋白含量。(2)HBE135-E6E7无血清培养24h,以JAK2抑制剂AG490和MUC5B抑制剂NAC(乙酰半胱氨酸)为处理因素,分为以下六组:A组:空白对照组;B组:IL-8最适浓度组(160ng/ml);C组:IL-8+AG490(50μmol/L)组;D组:AG490组;E组:IL-8+NAC(10mmol/L);F组:NAC,处理48h,RT-PCR检测MUC5B mRNA水平,ELISA法检测MUC5B蛋白水平,WB法检测p-JAK2、p-STAT6、JAK2、STAT6蛋白水平。结果:(1)IL-8可刺激肺上皮细胞中MUC5B产生,且MUC5B的表达随着IL-8浓度的增加而增加。(2)在一定浓度IL-8的作用下,MUC5B蛋白相对表达量随着时间的增加而增加。(3)加入MUC5B抑制剂NAC后,RT-PCR检测MUC5B mRNA水平,与E组相比,B组增高,C组降低(P<0.05),与A组相比,B组、C组表达均升高且B组升高更明显(P<0.05);加入JAK2抑制剂AG490后发现,相比于A组,B组p-STAT6、p-JAK2蛋白含量表达增加,MUC5B蛋白含量、mRNA表达增加,且有统计学意义(P<0.05)。相比于B组,C组p-STAT6、p-JAK2蛋白含量表达降低,MUC5B蛋白含量、mRNA表达降低,且有统计学意义(P<0.05)。而各组非磷酸化的STAT6、JAK2表达无明显变化。结论:(1)IL-8可刺激肺上皮细胞中黏蛋白MUC5B的表达,且与浓度、时间均有关。其中最适IL-8浓度为160ng/ml,最适处理时间为48h。(2)IL-8可能通过JAK2/STAT6途径调控MUC5B分泌。

食管鳞癌组织PTK6表达临床意义研究

目的探讨酪氨酸激酶-6(protein tyrosine kinase 6,PTK6)在食管鳞癌组织中的表达,及其与食管鳞癌发生发展及临床病理因素的相关性。方法采用免疫组织化学方法,检测2003-01-01-2005-12-01中山大学肿瘤防治中心胸外科切除的67例食管鳞癌及正常食管黏膜上皮组织中PTK6表达水平;在蛋白质和RNA水平检测7对手术切除的食管鳞癌及其癌旁组织标本中PTK6的RNA与蛋白表达情况。结果 PTK6在癌组织中的表达明显弱于癌旁正常黏膜组织,50.7%(34/67)的食管鳞癌组织中检测到PTK6蛋白高表达,73.1%(49/67)正常食管黏膜上皮组织中检测到PTK6蛋白高表达,两者差异有统计学意义,χ2=7.123,P=0.008。食管癌组织中PTK6表达水平与肿瘤浸润深度(χ2=0.647,P=0.03)和病理分级(χ2=0.577,P<0.001)密切相关,PTK6低表达组5年总生存率为31.9%,显著低于PTK6高表达组的77.3%,差异有统计学意义,P=0.021。RT-PCR及蛋白质印迹结果证实,无论是在基因水平还是蛋白水平,PTK6在食管鳞癌组织中均呈低表达。结论 PTK6在食管鳞癌的发生发展中起着重要作用,可能作为食管癌判断预后的独立预测因素。

穴位埋线联合艾灸对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织IL-6/JAK/STAT3信号通路的影响

目的:观察“天枢”“大肠俞”“上巨虚”穴位埋线联合艾灸对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠组织白细胞介素-6(IL-6)含量及酪氨酸激酶(JAK)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)表达的影响,探讨穴位埋线联合艾灸治疗UC的可能机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、埋线组、艾灸组、联合组,每组6只。采用三硝基苯磺酸/乙醇灌肠法制备UC大鼠模型。穴位选取双侧“天枢”“大肠俞”“上巨虚”。埋线组予埋线治疗,1次/7d,共2次。艾灸组予艾条温和灸治疗,10min/次,1次/d,共14d。联合组予艾条温和灸治疗,并于6h后进行埋线治疗,方法、疗程同埋线组、艾灸组。HE染色法观察结肠组织形态变化,ELISA法检测结肠组织IL-6含量,免疫组织化学法和Western blot法检测结肠组织JAK和STAT3的表达。结果:正常组大鼠结肠黏膜结构完整,无炎性细胞浸润;模型组大鼠结肠上皮组织结构破损模糊,大量炎性细胞浸润;埋线组、艾灸组和联合组大鼠结肠上皮组织损伤均有不同程度改善,联合组改善最明显。与正常组比较,模型组结肠组织IL-6含量及JAK、STAT3蛋白表达均明显升高(P<0.01)。与模型组比较,埋线组、艾灸组、联合组结肠组织IL-6含量及JAK、STAT3蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。与埋线组和艾灸组比较,联合组结肠组织JAK、STAT3蛋白表达降低更明显(P<0.01)。结论:埋线联合艾灸干预能有效下调IL-6含量及JAK和STAT3的表达,抑制炎性信号通路IL-6/JAK/STAT3的活化,促进损伤结肠组织的修复。

乳腺分泌性癌的临床病理特征分析

目的探讨乳腺分泌性癌(SCB)的临床病理特征。方法收集3例SCB的临床资料,采用免疫组化SP法检测雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、Ki-67、S100、CK5/6、p63、平滑肌肌动蛋白(SMA)、钙调理蛋白(calponin)、巨囊性病液体蛋白15(GCDFP-15)和表皮生长因子受体(EGFR)等的表达情况,采用荧光原位杂交技术检测ETS变异基因6-神经酪氨酸激酶受体3(ETV6-NTRK3)融合基因。结果例1和例2 ER(局灶弱+,约5%),例3 ER(-);例1 PR(局灶弱+,约5%),例2和例3 PR (-);3例均HER-2(-),S100(弥漫强+),CK5/6(+),SMA(-),calponin(-), GCDFP-15(-),EGFR(+)。例1 Ki-67指数为15%,例2为15%,例3为10%。例1大部分肿瘤细胞p63(-)、局灶区域细胞核(+)、局灶区域细胞质(+);例2 p63(-),例3肿瘤细胞p63染色细胞质(+)、部分分泌物阳性着色。3例均成功检测出ETV6-NTRK3融合基因。结论SCB是一种罕见的低级别特殊类型三阴性乳腺癌,具有独特的病理形态学特征,分子遗传学上具有特征性t(12;15)(p13;q25)平衡易位,产生ETV6-NTRK3融合基因,临床过程惰性,预后好。