颈动脉中两个主要酪氨酸磷酸化蛋白质,FAK和Paxillin在球囊损伤后减少(英文)

目的 确定正常动脉中主要的酪氨酸磷酸化蛋白质以及它们在球囊损伤后的变化。方法和结果 用矾酸钠溶液灌注Sprague Dawley鼠的同时 ,分别切除正常的及球囊损伤后的颈动脉 ,主动脉和其它组织 ;使之云浆化 ,将澄清的组织溶解产物用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀反应 ,然后用FAK ,Paxillin和磷酸酪氨酸的抗体进行Western印迹分析 ,结果显PP12 5和PP6 8是两个主要存在于正常颈动脉的酪氨酸磷酸化蛋白质 ,用FAK和Paxillin的抗体再探查后确定了这些蛋白质是FAK和Paxillin ;用磷酸酪氨酸抗体免疫去除法可消除FAK和Paxillin ,表明这些蛋白质大多数在动脉中被酪氨酸磷酸化 ;动脉中比其它被检查的组织 ,如下腔静脉和心脏包含更多酪氨酸磷酸化的FAK。随后进行的颈动脉球囊损伤后检测显示FAK和Paxillin的含量减少。结论 我们的发现表明FAK和Paxillin在保持动脉的正常结构和功能上发挥了重要作用 。

不同转移潜能人肝癌细胞系酪氨酸磷酸化蛋白质差异分析

目的研究不同转移潜能人肝癌细胞系中酪氨酸磷酸化蛋白质表达的差异并筛查与肝癌转移相关的酪氨酸磷酸化蛋白质分子。方法应用双电泳(2-D E)、免疫印迹法及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析,对三种不同转移潜能人肝癌细胞系Hep 3B、MHCC97L和MHCC97H进行酪氨酸磷酸化蛋白质组分析。结果对照2-DE胶和免疫印迹发光胶片,Hep3B检测到10个点,MHCC 9 7L检测到19个点, MHCC97H检测到17个点。经质谱鉴定,得到膜连蛋白Ⅰ等19个差异点。结论细胞内酪氨酸磷酸化蛋白的表达差异与肝癌的侵袭转移有关。

高转移肝癌细胞HCCLM6的酪氨酸磷酸化蛋白质组学研究

目的探讨肝癌细胞系HCCLM6细胞的酪氨酸磷酸化(pTyr)肽段富集方法,建立快速、高效和高特异性的酪氨酸磷酸化蛋白质组学实验技术。方法通过基于SH2超亲体材料酪氨酸磷酸化肽段亲和纯化技术,并结合液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)实现HCCLM6细胞中酪氨酸磷酸化肽段的大规模富集;通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测HCCLM6细胞蛋白的提取质量;LC-MS/MS检测富集得到的酪氨酸磷酸化肽段;采用MaxQuant软件实现对质谱数据的分析。结果实现了对HCCLM6细胞酪氨酸磷酸化肽段的大规模富集,建立了稳定高效的酪氨酸磷酸化蛋白质组学实验技术,共鉴定到1105个酪氨酸磷酸化蛋白,2666个酪氨酸磷酸化肽段,1884个酪氨酸磷酸化位点;酪氨酸磷酸化蛋白主要富集在黏附、细胞内吞、紧密连接等与转移相关的生物学进程;所鉴定的多种酪氨酸磷酸化蛋白质有效补充了已报道的酪氨酸磷酸化数据库,可为肝癌转移机制相关研究提供新的治疗靶点。结论建立了稳定高效的酪氨酸磷酸化蛋白质组学实验技术,实现了对HCCLM6细胞酪氨酸磷酸化肽段的大规模富集。

应用磷酸化蛋白质组学方法初步研究喉癌相关基因LCRG1的功能

mRNA差异显示技术克隆的喉癌相关基因LCRG1,对不表达该基因的喉癌细胞系(Hep-2)的生长具有明显抑制作用.软件分析推测,LCRG1可能在细胞信号传导中发挥作用.为进一步地研究LCRG1的功能,应用RT-PCR和平板克隆形成实验证实,经多次传代的Hep-2/LCRG1细胞,仍表达LCRG1,且LCRG1具有显著的抑制细胞增殖的能力.抽提Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系总蛋白质,应用固相pH梯度(IPG)双向凝胶电泳(2DGE),结合抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),鉴定酪氨酸磷酸化的蛋白质.得到了分辨率较高、重复性较好的Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的总蛋白质双向凝胶电泳图谱;结合免疫印迹反应、软件分析和质谱技术识别并鉴定了13个差异反应的酪氨酸磷酸化的蛋白质.这些蛋白质参与了细胞信号传导和细胞代谢等过程.推测LCRG1可能是通过调节这些蛋白质的酪氨酸磷酸化、去磷酸化状态,参与细胞增殖、代谢和凋亡等过程的调控,而发挥抑瘤作用.这为全面、真实地揭示LCRG1抑瘤作用的分子机理提供了新思路.

中华眼镜蛇毒F组份对血小板活化时蛋白酪氨酸磷酸化的影响

目的 :观察中华眼镜蛇毒F组份抑制血小板聚集的胞内信号转导机制。方法 :实验分 6组 :(1)空白组 ;(2 )对照组 ;(3) - (6 )实验组加入浓度为 10 0、30、10、3mg/LF组份。用比浊法测定血小板聚集率。用蛋白质免疫印迹法 (Westernblotting)测定血小板内蛋白酪氨酸磷酸化的表达。结果 :F组份呈浓度依赖性抑制二磷酸腺苷 (ADP)引起的分子量为 76、6 6和 37 5kD蛋白酪氨酸磷酸化的表达 ,其中 30、10 0mg/L给药组中 ,3个分子量蛋白与对照组比较均有显著差异 ,P <0 . 0 5。F组份对ADP引起血小板聚集作用的抑制同降低 76、6 6和 37 5kD 3个分子量蛋白酪氨酸磷酸化的表达呈明显的正相关 (r=0 . 936 7,P <0 . 0 1)。结论 :中华眼镜蛇毒F组份通过抑制分子量为 76、6 6和37 5kD蛋白的酪氨酸磷酸化表达 ,对血小板胞内信号转导过程发生影响 ,可能是其抗栓机制之一。

过表达PTPα促进K562细胞体外增殖能力和体内致瘤性

探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶α(PTPα)在血液肿瘤细胞中的特异性表达,研究过量表达PTPα对人红白血病细胞K562生物学行为的影响及在裸鼠体内致瘤能力的改变.首先应用RT-PCR和Western印迹检测3种不同类型造血系肿瘤细胞(K562、NB4、Jurkat T)中PTPα的表达水平.根据检测结果,选择K562细胞作为研究对象,利用脂质体将PTPα真核表达载体转染K562细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR和Western印迹验证过表达情况;经MTT法检测细胞增值能力的改变;用流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞分化状态;并将阳性克隆细胞皮下接种裸鼠,观察PTPα基因转染前后细胞系在裸鼠体内的致瘤能力及瘤体的组织化学变化.上述实验结果表明,通过G418压力筛选获得了PTPα高表达多克隆细胞系K562-PTPα;经体外增殖实验分析,实验组K562-PTPα细胞与未转染组细胞K562和转染空载体组细胞K562-splice相比,细胞生长速度增快,G2/M期细胞比例增加(P<0.05),而细胞分化状态无明显变化;裸鼠体内致瘤实验显示,K562组、K562-splice组和K562-PTPα组平均瘤重分别为(1.1±0.3)g、(1.3±0.2)g和(2.5±0.5)g;病理切片显示,K562-PTPα组瘤体组织分化程度较对照组低、恶性程度高,细胞的致瘤能力增强(P<0.01).综上所述,过表达PTPα使K562细胞具有更强的体外增殖能力和体内致瘤性,表明PTPα可能在造血系统恶性肿瘤的发生发展中发挥促进作用.