兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的:采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP-oc)多克隆抗体并鉴定其性能。方法:将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21(DE3)中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果:成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32 000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论:成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。

巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2的克隆表达及其与骨质疏松症的关系

目的:探讨巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2(PTPMEG2)的克隆表达及其对骨质疏松症发展过程的调节作用。方法:分离纯化后的PTPMEG2蛋白,应用免疫学技术制备PTPMEG2的多克隆抗体。30只雌性SD大鼠随机分为模型组(n=15)和对照组(n=15),采用维甲酸灌胃给药的方法构建大鼠骨质疏松症模型,对照组大鼠采用生理盐水灌胃,检测2组大鼠血清中酸性磷酸酶(ACP)及碱性磷酸酶(ALP)的水平。Western blotting法检测大鼠各组织中PTPMEG2的表达水平,并对比PTPMEG2在骨髓细胞(BMCs)、红细胞及骨髓基质细胞(BMSCs)中表达量的变化。结果:成功制备PTPMEG2的多克隆抗体。模型组大鼠血清中ACP和ALP表达水平均高于对照组(P<0.01),且模型组大鼠的骨脆性明显高于对照组。模型组大鼠肾脏组织中PTPMEG2的表达水平高于对照组(P<0.05),而其在肌肉组织中的表达水平却低于对照组(P<0.05)。与对照组比较,PTPMEG2在模型组大鼠BMCs中表达量显著增加,而在红细胞和BMSCs中其表达量无明显差异。结论:骨质疏松症大鼠BMCs中PTPMEG2表达水平增加,且多发生在骨髓内分化成熟的骨细胞中;PTPMEG2可能在骨质疏松症的发展过程中发挥重要的调节作用。

磷酸化蛋白质组学鉴定PTPLAD1调控的结肠癌细胞酪氨酸磷酸化蛋白质

目的:用磷酸化蛋白质组学的方法鉴定并分析结肠癌细胞中含蛋白酪氨酸磷酸酶样A结构域蛋白1(PTPLAD1)调控的酪氨酸磷酸化蛋白。方法:运用siRNA技术沉默PTPLAD1的表达,于细胞培养条件下运用氨基酸稳定同位素标记技术(stable lsotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)标记细胞,用酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白,用LTQ-Orbitrap XL质谱鉴定因敲低PTPLAD1所出现的差异表达的酪氨酸磷酸化蛋白,进一步利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件对这些差异蛋白进行生物信息学分析。结果:用real-time PCR筛选得到有效的siRNA干扰片段,Western blot验证其干扰效果及有效干扰时间。质谱鉴定PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白共20个,其中显著上调的8个,显著下调的10个,主要为转录因子及肿瘤标志物相关蛋白。IPA软件的结果表明PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白的功能主要与器官发育分化、维持组织分化类型及细胞凋亡、增殖相关。结论:成功鉴定出PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白,可以为后续研究PTPLAD1在结肠癌的发生发展中的作用及机理提供基础。

靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B小分子干扰RNA对结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响

目的:探讨沉默蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因的RNA干扰对人结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响。方法:应用小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默PTP1B的表达(shRNA-PTP1B),采用逆转录聚合酶链反应和Western Blot分别在mRNA和蛋白水平检测抑制效果。CCK-8被用于检测沉默PTP1B表达对肿瘤细胞增殖的影响。在体外实验的基础上建立裸鼠模型,建立稳定表达干扰RNA细胞系,观察干扰RNA稳定表达对人结肠癌裸鼠移植成瘤的影响。结果:shRNA-PTP1B有效沉默LoVo细胞PTP1B mRNA及蛋白的表达,成功筛选shRNA-PTP1B稳定表达细胞株LoVo/shRNA细胞。在体外试验中与对照组比较LoVo/shRNA细胞的增殖能力明显下降。LoVo/shRNA细胞裸鼠移植成瘤体积,明显减小(P均<0.05)。结论:shRNA-PTP1B可以沉默人结肠癌PTP1B基因的表达,显著抑制LoVo细胞的增殖,降低LoVo细胞的成瘤能力。

PY20抗体检测bcr-abl阳性细胞内磷酸化酪氨酸的临床应用

目的探讨酪氨酸磷酸化抗体 PY20检测 bcr-abl 阳件细胞的特异性及其可能的临床应用。方法采用多色直接免疫荧光标记方法,同时标记膜 CD45和胞质 PY20抗体,应用流式细胞术检测 bcr-abl 阳性细胞系(K562、MEG-01)和阴月性细胞系(Jurkat、MCF-7)的酪氨酸磷酸化水平。并利用bcr-abl 蛋白酪氨酸磷酸化特异性阻断剂伊马替尼作用 K562细胞和 MEG4-01细胞,观察 PY20抗体的特异性。检测了49例白血病患者和3名正常人的骨髓细胞,包括慢性粒细胞白血病(CML)、Ph^+急性淋巴细胞白血病(Ph^+ ALL)、Ph^- ALL、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病。PY20^+细胞占白血病细胞群的10%以上定义为阳忡。以阳性细胞的平均荧光强度(MFI)表示其酪氨酸磷酸化水平。结果bcr-abl 阳性细胞系、10例初诊 CML 和8例 Ph^+ALL 患者 PY20抗体均为阳性,而 bcr-abl 阴性细胞系、20例 bcr-abl 阴性白血病患者和3名正常人 PY20抗体均为阴性。伊马替尼作用后 K562细胞和MEG-01细胞的酪氨酸磷酸化水平随作用时间的延长逐渐下降。10例初诊和9例伊马替尼治疗有效的 CML 患者 PY20^+细胞占有核细胞的比例分别为(54.20±19.82)%和(14.84±6.17)%(P<0.05),而2例伊马替尼耐药者 PY20^+细胞比例分别为64.3%和57.2%。2例伊马替尼耐药患者和9例伊马替尼治疗有效患者的 CML 细胞的 MFI 分别为99.42±4.87和46.41±4.67(P<0.01)。结论酪氨酸磷酸化抗体 PY20对 bcr-abl 阳性细胞具有相对特异性,有可能应用于 bcr-abl 阳性疾病如 CML 和Ph^+ALL 的早期快速辅助诊断,同时有可能作为判断该类疾病对伊马替尼敏感性的一个辅助指标。

胰岛细胞自身抗体联合检测对成人糖尿病免疫学诊断的意义

目的探索胰岛细胞抗体、谷氨酸脱羧酶抗体和酪氨酸磷酸酶样蛋白抗体联合检测,对成人糖尿病免疫学诊断、鉴别诊断的临床意义。方法随机选取新诊断的成人糖尿病患者786例,用ELISA法分别检测患者血清GAD-Ab、ICA、IA-2A,比较单独检测和联合检测阳性率的差异。结果 786例血清胰岛细胞自身抗体ICA、GADA和IA-2A阳性率分别为18.2%、10.5和17.9%;3种胰岛细胞自身抗体联合检测可提高LADA的诊断率;20-45岁新诊断成人糖尿病患者的胰岛细胞自身抗体ICA、GADA和IA-2A联合检测阳性率高于46-65岁组。结论新诊断成人糖尿病血清胰岛细胞自身抗体（ICA、GADA和IA-2A）联合检测有利于2型糖尿病中区分出自身抗体阳性的成人糖尿病,20-45岁组的胰岛细胞自身抗体的阳性率高于46-65岁组。

肺癌组织PTPN6、PAX8表达水平及其与患者预后的关系

目的:探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶非受体型6(PTPN6)、配对盒基因8抗体(PAX8)在肺癌组织中表达水平及其与患者预后的关系。方法:选取本院2019年1月至2021年1月收治的86例肺癌患者,在术中收集癌组织和癌旁组织。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织中PTPN6、PAX8的mRNA表达,采用免疫组化法检测组织中PTPN6、PAX8的蛋白表达。结果:PTPN6 mRNA在肺癌组织中的表达低于癌旁组织(P<0.05);PAX8 mRNA在肺癌组织中的表达高于癌旁组织(P<0.05);肺癌组织中PTPN6蛋白阳性表达的患者3年生存率高于阴性表达者(P<0.05);PAX8蛋白阳性表达的患者3年生存率低于阴性表达者(P<0.05);淋巴结转移、肿瘤直径>3.0 cm、低分化、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、PTPN6阴性表达、PAX8阳性表达为影响肺癌患者预后的危险因素(P<0.05)。结论:肺癌组织PTPN6表达水平下降,PAX8表达水平上升,可作为评估患者预后的指标。

胰岛自身抗体在糖尿病中的应用及研究进展

糖尿病是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷引起的,以慢性高血糖为特征的一种比较常见的内分泌代谢性疾病。目前,临床上根据病因对糖尿病进行分类,主要有1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病4种类型,其中T1DM与胰岛自身免疫联系甚密。T1DM主要见于儿童和青少年,是儿童期最常见的内分泌代谢性疾病之一[1]。

从基于结构定义的序列模体识别蛋白质的超家族

以进化上相距较远的蛋白质酪氨酸磷酸酶Ⅰ和Ⅱ为例,通过结构比较和基于结构的序列比对及共同保守区域残基替换模式的分析,定义了基于结构的序列模体.利用这种新的模体对SWISS-PROT和TrEMBL蛋白质序列库进行搜索,可特异性地同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ,其识别正确率可达98.4％.而在此之前,尚未见可同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ序列模体的报道.

血清GADA、ICA、IAA、IA-2A的测定在糖尿病分型中的应用及诊断价值

[目的]探讨糖尿病自身抗体对糖尿病分型的诊断价值。[方法]实验分为3组,1型糖尿病(T1DM)组、2型糖尿病(T2DM)组、正常对照组。采用免疫印迹试剂法对糖尿病自身抗体GADA、ICA、IAA、IA-2A进行分析。[结果]GADA、ICA、IAA、IA-2A在T1DM组中检出率分别为65.33%、38.00%、24.67%、10.67%,在T2DM组分别为17.27%、13.69%、12.50%、5.95%,以及正常对照组中为0.00%、1.00%、0.00%、2.00%。T1DM和T2DM与正常对照组比较均有显著性差异P<0.05;T1DM与T2DM比较其阳性率明显高于T2DM,P<0.05,GADA最易检出。[结论]GADA、ICA、IAA、IA-2A的测定对糖尿病的诊断和分型有重要的临床意义;联合检测能提高阳性率,避免漏诊。

成人隐匿性自身免疫糖尿病的预测与诊断

目的探讨临床初诊为2型糖尿病(T2DM)患者中成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)的患病率及与自身抗体的关系。方法对1221例临床初诊为T2DM患者采用ELISA法测定谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)和酪氨酸磷酸酶抗体(IA2-Ab)水平,了解LADA的患病率并分析其临床特征。结果临床初诊为T2DM患者中LADA检出率为8.27%(101/1221),其中GAD-Ab和IA2-Ab的阳性率分别为5.56%和0.90%。抗体阳性组患者年龄、病程、空腹及餐后2hC肽值均明显低于抗体阴性组患者(P<0.05)。结论自身抗体阳性患者存在明显的胰岛功能损伤,从T2DM患者中及早检出LADA对指导治疗以及改善预后具有重要意义。

急性脑梗死患者颈动脉内膜中层厚度与血浆血管内皮细胞钙黏蛋白、溶血磷脂酸含量的变化

目的探讨急性脑梗死患者颈总动脉平均内膜中层厚度(IMT)与血浆血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)、溶血磷脂酸(LPA)的含量变化及其在脑梗死发生过程中的意义。方法对104例脑梗死患者采用高分辨率彩色多普勒超声显像仪测量颈动脉IMT,并采用酶联免疫法测定血浆VE-cadherin,采用有机溶剂抽提并进一步分离出LPA,以定磷方法测定LPA水平,与60例年龄和性别相当的健康体检者(对照组)进行比较。结果急性脑梗死患者颈动脉IMT和血浆VE-cadherin、LPA含量较对照组显著升高;急性脑梗死患者颈动脉IMT和血浆VE-cadherin、LPA含量之间存在相关性。结论检测脑梗死患者颈动脉IMT和血浆VE-cadherin、LPA含量变化有助于预测脑梗死的发生。

GADA、ICA、IAA及IA-2测定在糖尿病诊断分型中的意义

目的探讨胰岛β细胞自身抗体检测在糖尿病分型及诊断中的意义。方法对30例1型糖尿病、168例2型糖尿病及100例健康对照者进行GADA、ICA、IAA及IA-2检测。结果GADA、ICA、IAA及IA-2在1型糖尿病组中检出率分别为60%、40%、40%、6·67%,在2型糖尿病组分别为21·18%、14·29%、1·19%、0·60%,以及健康人群中分别为1·00%、1·00%、0·00%、0·00%。1型糖尿病阳性率明显高于2型糖尿病阳性率。GADA最易检出,IA-2只在T1DM中检出率高。联合抗体检测较单一抗体检测检出率高。结论GADA是糖尿病最有价值免疫学指标,IA-2是急性1型糖尿病免疫学诊断指标。

针对EGFR靶点的肿瘤治疗

表皮生长因子受体 (EGFR)自分泌途径在多种实体瘤生长中起重要作用 ,以EGFR作为靶点的药物如抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂等已在临床肿瘤治疗方面显示出良好的应用前景。

先兆子痫病理生理学新进展

先兆子痫患者日后患心血管病的机率明显增加,可能与血管内皮功能失调有关。先兆子痫的发病与胎盘血管重铸过程中分子信号传导路径异常导致一些转录蛋白、生长因子、细胞因子异常表达有关,与体内抗血管紧张素受体的刺激性自身抗体(AT1R鄄AA)有关。先兆子痫患者体内高水平的可溶性fms样酪氨酸激酶鄄1(sFlt1)可作为预测指标。

miR-208a促进非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的功能和机制研究

目的探讨miR-208a对非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法(1)分别用miR-208a mimic、NC mimic、miR-208a inhibitor和NC inhibitor转染A549细胞。采用荧光定量PCR(qPCR)检测A549细胞中miR-208a过表达和干扰效率;采用CCK-8实验、Transwell实验和划痕实验检测miR-208a对A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响。利用生物信息学网站PicTar、miRanda、Targetscan和miRDB预测与miR-208a结合的下游靶基因;构建蛋白酪氨酸磷酸酶受体G(PTPRG)的3′UTR野生型和突变型双荧光素报告酶基因载体,和miR-208a共转染到HEK-293T细胞后观察荧光素酶活性变化。(2)取对数生长期的A549细胞,设置阴性对照组(si-NC组)、PTPRG敲低组(si-PTPRG组)和PTPRG敲低组+miR-208a干扰组(si-PTPRG+miR-208a inhibitor组),采用CCK-8、Transwell实验和划痕实验检测PTPRG对A549增殖、侵袭和迁移的影响,qPCR和Western blot检测3组细胞PTPRG的mRNA和蛋白表达变化。结果(1)miR-208a mimic组miR-208a基因表达水平、细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移率均高于NC mimic组(P<0.05);miR-208a inhibitor组的miR-208a基因表达水平、细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移率均低于NC inhibitor组(P<0.05)。生物信息学分析显示PTPRG是miR-208a的靶基因,双荧光素报告酶实验结果显示miR-208a过表达能够降低PTPRG 3′UTR野生型的荧光素酶活性,而敲低miR-208a能够增加PTPRG 3′UTR野生型的荧光素酶活性,miR-208a能够与PTPRG的3′UTR序列结合。(2)与si-NC组相比,si-PTPRG组细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移能力明显增高,PTPRG基因和蛋白表达水平下降(P<0.05);而与si-PTPRG组相比,si-PTPRG+miR-208a inhibitor组细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移能力下降,PTPRG基因和蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论miR-208a可能通过靶向调控PTPRG来促进A549细胞的增殖、侵袭和迁移。

雌二醇通过磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B通路调控人肾小管上皮细胞ABC转运蛋白2表达的研究

目的观察痛风患者与健康人群血清中雌二醇水平差异，雌二醇对人肾小管上皮细胞（HK-2）尿酸转运体ABC转运蛋白2（ABCG2）表达的影响，并研究磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B（P13K／Akt）通路在雌二醇调控HK-2细胞ABCG2表达中的作用。方法以ELISA法检测收集的16例男性痛风患者组及16qk男性健康人群组血清雌二醇水平，尿酸由自动生化仪测得。分别以不同浓度雌二醇刺激HK．2细胞24h或48h，以实时荧光定量PCR（qPCR）法检测ABCG2表达。以雌二醇或雌二醇及P13K／Akt抑制剂LY294002共同刺激HK-2细胞，qPCR法检测ABCG2表达，蛋白印迹法检测Akt、D—Ser473-Akt．p-Thr308-Akt及ABCG2表达变化。采用方差分析或t检验分析数据。结果痛风患者组血尿酸水平[（547±18）μmol／L]明显高于健康人群[（344±12）μmol／L]（t-5．395，P〈0．01）。痛风患者组雌二醇水平[（45±6）μmol／Ll较健康人群组[（100±8）μmol／L]明显降低（t=9．375，P〈0．01）。10-4mol／L组雌二醇刺激HK-2细胞24h或48h后，ABCG2mRNA水平均升高（t=3．168，t=3．990；P〈0．01）。雌二醇及PI3K／Akt抑制剂LY294002共同干预HK-2细胞组，较单以雌二醇干预组，ABCG2、p-Ser473．Akt及p-Thr308-Akt表达下降，Akt表达差异无统计学意义。结论雌二醇与血尿酸水平有明显的相关性，雌二醇可通过激活P13K／Akt通路发挥上调人肾小管上皮细胞ABCG2表达的作用。

4种自身抗体联合检测对1型糖尿病诊断的意义

目的探讨联合检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、蛋白质酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)、锌转运体8抗体(Zn T8A)和胰岛特异的葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白抗体(IGRPA)对1型糖尿病患者诊断的意义。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)对45例1型糖尿病患者、50例2型糖尿病患者及50例正常对照者血清进行GADA、IA-2A、Zn T8A及IGRPA自身抗体的检测。结果 IA-2A、GADA、Zn T8A和IGRPA在1型糖尿病患者中检出率分别为28.89%、53.33%、71.11%和77.78%。4种自身抗体的阳性率在1型糖尿病患者中高于2型糖尿病组及正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。自身抗体联合检测敏感度均高于单项组,GADA/IA-2A/Zn T8A/IGRPA 4项联合检测敏感度及曲线下面积(AUC)均为最高,分别为95.56%和0.988。结论 GADA、IA-2A、Zn T8A和IGRPA抗体的联合检测可以显著提高1型糖尿病的检出率,对1型糖尿病的诊断具有重要意义。

血清GAD-Ab、ICA、IAA联合检测对糖尿病诊断及分型中的运用研究

目的探讨糖尿病自身抗体在糖尿病诊断及分型中的价值。方法分别设定3组。1型糖尿病(T1DM)组,2型糖尿病(T2DM)组,正常对照组。采用免疫印迹试剂检测糖尿病GADA、ICA、IAA、IA-2A自身抗体后进行分析。结果 T1DM和T2DM自身抗体的阳性率高于正常对照组,与正常对照组相比较均有显著性差异P<0.05;T1DM与T2DM比较,T1DM其阳性率明显高于T2DM,比较有显著性差异P<0.05,GADA检出率最高。结论 GADA、ICA、IAA、IA-2A的测定对糖尿病的诊断和分型有重要的指导作用,联合检测能提高准确性。