鞣花酸抑制酪氨酸酶的动力学、荧光光谱分析及分子对接

以蘑菇酪氨酸酶为靶点,采用抑制动力学、荧光光谱分析结合分子对接模拟技术,系统研究鞣花酸(ellagic acid,EA)对酪氨酸酶的抑制作用及机理。体外研究与动力学结果表明,EA以可逆的混合型抑制方式显著抑制酪氨酸酶活性(IC_(50)=0.05mg/mL),其结合常数K_(I)<K_(IS),表明EA与游离酶的结合比与酶-底物复合物的结合更紧密。荧光光谱猝灭分析表明,EA与酪氨酸酶存在静态猝灭作用,两者通过自发的吸热过程结合生成复合物,主要作用力为疏水作用力,只有1个或1类结合位点。同步和三维荧光光谱分析表明,EA使酪氨酸酶的微环境极性增大,疏水能力减弱,酪氨酸酶的Trp残基更靠近结合位点。分子对接模拟分析进一步印证上述实验结果,形象地表明EA对酪氨酸酶为混合型抑制,EA主要通过疏水作用力和氢键与游离酶或酶-底物复合物进行结合,最终导致酶活性降低。本研究对EA在食品工业中作为保鲜剂的各种应用具有一定参考意义。

酪氨酸酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶基因在皱纹盘鲍初生壳形成中的表达分析

为研究软体动物贝壳发育区形成机制,实验通过扫描电子显微镜观察分析了皱纹盘鲍贝壳发育区的形态特征,鉴定了皱纹盘鲍的酪氨酸酶(Hdi-Tyr1和Hdi-Tyr2)、过氧化物酶(Hdi-Prx1、Hdi-Prx2)和碱性磷酸酶(Hdi-Alp)等5个贝壳形成相关的候选基因,并通过整装原位杂交技术解析了各基因在皱纹盘鲍早期幼虫发育过程中的表达模式。结果显示,皱纹盘鲍贝壳发育区由至少3种特征差异明显的细胞组成,酪氨酸酶基因(Hdi-Tyr1和HdiTyr2)在担轮幼虫的贝壳发育区呈“U”形表达,在面盘幼虫外套膜的长柱状细胞中表达,而碱性磷酸酶(Hdi-Alp)和过氧化物酶(Hdi-Prx1和Hdi-Prx2)基因仅表达在幼虫的担轮环和头部。研究表明,Hdi-Tyr1和Hdi-Tyr2基因可能参与了皱纹盘鲍担轮幼虫和面盘幼虫的贝壳形成过程,而过氧化物酶基因Hdi-Prx1和Hdi-Prx2以及碱性磷酸酶基因Hdi-Alp并不参与初生壳的发育过程,实验结果为深入解析软体动物的贝壳发育机制和贝壳相关性状的种质创新提供了基础支撑。

枹丝锥叶中多酚类成分的分离及其酪氨酸酶抑制活性研究

采用Chromatorex C18、Toyopearl HW-40F、Sephadex LH-20等柱层析法对枹丝锥叶80%甲醇提取物进行分离纯化,根据NMR数据及与文献对照确定化合物结构,考察了分离得到的主成分的酪氨酸酶抑制活性。从枹丝锥叶中分离鉴定得到18个化合物,其中酚酸类化合物9个,鞣花单宁类3个,黄酮类化合物6个,分别鉴定为原儿茶酸(1)、没食子酸(2)、顺式对羟基肉桂酸(3)、反式对羟基肉桂酸(4)、3-O-没食子酰基莽草酸(5)、4,5-二-O-没食子酰基奎宁酸(6)、1,3,5-三-O-没食子酰基奎宁酸(7)、3,4,5-三-O-没食子酰基奎宁酸(8)、1,3,4,5-四-O-没食子酰基奎宁酸(9)、2,3-O-(S)-六羟基二苯酰基-β-D-吡喃葡萄糖(10)、punicacortein A(11)、pterocarinin A(12)、槲皮素(13)、杨梅素-7-O-β-D-吡喃半乳糖苷(14)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(15)、杨梅素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(16)、杨梅素-3-O-(6″-没食子酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷(17)、杨梅素-3-O-(2″-没食子酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷(18),所有化合物均为首次从枹丝锥中分离得到。化合物2、8、12、13对酪氨酸酶具有一定的抑制活性,其中化合物13对酪氨酸酶的抑制效果最好,半数抑制质量浓度(IC_(50))值为(0.420±0.08)g/L,优于阳性对照曲酸(IC_(50)值0.099 g/L±0.01 g/L)。

葛根素衍生物的设计合成及其对酪氨酸酶的激活作用研究

以葛根素为原料,设计合成8个葛根素衍生物(PD_(1)~PD_(8)),通过质谱和核磁共振氢谱确定其化学结构,利用酪氨酸酶多巴速率氧化法测定各衍生物对酪氨酸酶的激活活性,并利用分子对接模拟探讨各衍生物与酪氨酸酶的结合情况,酶动力学分析确定激活类型。8个葛根素衍生物结构鉴定为:4'-甲氧基-葛根素(PD_(1))、4'-乙氧基-葛根素(PD2)、4'-丙氧基-葛根素(PD3)、7-O-乙酰基-葛根素(PD4)、7-O-三甲基乙酰基-葛根素(PD5)、7-甲氧基-葛根素(PD6)、7-O-乙氧羰基亚甲基-葛根素(PD7)、7,4'-O-二乙氧羰基亚甲基-葛根素(PD_(8))。激活活性测定结果表明:PD6为混合型激活,PD6的半激活浓度EC50=0.416 mmol/L,高于葛根素(EC50=0.434 mmol/L)。

红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白制备抗酪氨酸酶活性肽及其活性表征

为有效利用红鳍东方鲀鱼皮制备胶原蛋白活性肽,本研究采用响应面法优化水解条件,制备红鳍东方鲀鱼皮酸溶性胶原蛋白的抗酪氨酸酶活性肽,通过评价经超滤分级后不同分子质量肽的抗酪氨酸酶活性、抗氧化活性、模拟消化后活性动态变化及吸湿、保湿性能差异,探究其应用潜力。结果表明,利用中性蛋白酶进行酶解,最佳工艺条件为底物质量浓度2.9 g/100 mL、酶解时间7.8 h、酶添加量7862 U/g。在此条件下,酪氨酸酶活性抑制率为(35.14±0.03)%。酶解产物分子质量主要分布于0~5 kDa。抗酪氨酸酶活性较高组分为CP-1(<3 kDa),其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基和羟自由基清除率的半抑制浓度分别为9.51、2.03 mg/mL和7.29 mg/mL。经体外模拟消化后CP-1仍具有较高的抗酪氨酸酶活性和抗氧化活性。此外,CP-1具有较高的吸湿、保湿性能,可代替甘油。本研究可为红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白肽的精深加工与应用提供理论依据。

琯溪蜜柚疏果黄酮酶法辅助提取工艺优化及其抑制酪氨酸酶活性

本论文旨在探讨β-葡萄糖苷酶法辅助提取琯溪蜜柚疏果黄酮的工艺及提取得到的黄酮对酪氨酸酶抑制作用。以总黄酮提取量为指标,采用单因素实验及响应面试验对β-葡萄糖苷酶酶活力、酶解pH、温度及时间进行优化,并研究总黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制作用。结果表明,通过单因素实验和响应面试验优化得到琯溪蜜柚疏果黄酮提取的最优条件是:β-葡萄糖苷酶酶活力0.0128 U/mL、酶解pH4.4、酶解温度35℃、酶解时间4.8 h,在该工艺条件下疏果总黄酮提取量为34.0 mg/g;该黄酮提取物对酪氨酸酶的半抑制浓度(IC50)为0.31 mg/mL。本研究结果说明酶法工艺可显著提高琯溪蜜柚疏果黄酮的提取量,且琯溪蜜柚疏果黄酮具有较强的酪氨酸酶抑制作用,研究结果为琯溪蜜柚疏果黄酮提取及应用提供了参考依据,有利于促进琯溪蜜柚的高值化利用。

高温处理对补骨脂浸膏中酪氨酸酶活性成分的影响

采用高效液相色谱法同时测定高温处理后补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂素异黄酮、补骨脂二氢黄酮用甲醚、大豆苷元、补骨脂甲素和补骨脂乙素等七种成分的含量变化,及采用体外酪氨酸酶多巴速率氧化微量法测定七种成分的酪氨酸酶活性,评价高温处理对补骨脂中酪氨酸酶活性成分的影响.结果显示,与高温处理前相比,高温处理后补骨脂中7种成分的含量发生了变化;在补骨脂注射液100℃30 min条件下,除大豆苷元的含量最高外,其他6种成分的含量均不是最高,但是补骨脂素和异补骨脂素的含量下降最多;补骨脂素和异补骨脂素在浓度较低时对酪氨酸酶具有抑制作用,其他5种成分对酪氨酸酶均有不同程度的激活作用.可见,高温处理对补骨脂中酪氨酸酶活性成分具有一定的影响,该研究可为补骨脂的进一步研究提供参考与依据.

基于酪氨酸酶交联的豌豆蛋白-绿原酸-壳聚糖复合膜的构建及相关品质分析

以豌豆蛋白(pea protein,PP)为成膜基质,壳聚糖(chitosan,CS)为改善成膜性材料,绿原酸(chlorogenic acid,CA)为功能性成分,酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)为PP、CS和CA的交联剂,以甘油为增塑剂制备PP-CA-CS复合膜,测定PP-CA-CS复合膜物理指标以及微观结构表征,旨在探究PP与CS比例、CA添加量与Tyr添加量对PP-CA-CS复合膜结构及性能的影响,研究其组分间的作用机制。结果表明,添加CA后PP-CA-CS复合膜抗氧化性和机械性能有显著提高,并且在Tyr催化条件下,CA可与PP和CS进行共价交联,随着CA和Tyr的添加,交联度和力学性能得到进一步改善。当PP与CS比例为1∶1、CA添加量为20 mmol/L、Tyr添加量为18 U/mL时,PP-CACS复合膜的机械性能、抗氧化性能、水蒸气阻隔性能表现最优。此时膜的抗拉强度为130.78 MPa,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率为69.05%,改善后的PP-CA-CS复合膜与空白膜相比,机械性能增强了2.6倍,抗氧化性能提高了2.2倍,水蒸气透过率降低了8%。扫描电子显微镜测定结果表明,PP-CA-CS复合膜具有光滑、致密性好的特点,从而具有较优的水蒸气阻隔性能,并且通过红外光谱的分析,在成膜过程中没有产生新的官能团。本研究为新型食品包装领域开拓了新的研究思路,为可食用膜的开发提供了数据支持和理论支撑。

铜藻多酚的提取工艺及其稳定性和抑制酪氨酸酶活性

对铜藻多酚提取工艺、稳定性及其对酪氨酸酶活性的抑制作用进行研究。以新鲜铜藻为原料提取铜藻多酚,以铜藻多酚提取率为指标,考察乙醇体积分数、提取时间、液料比对铜藻多酚提取率的影响,并根据Box-Behnken试验设计对铜藻多酚的提取条件进行优化,得到铜藻多酚的最佳提取条件:乙醇体积分数40%、超声时间53 min、液料比为60∶1(mL/g),在该条件下所制备的铜藻多酚具有较高的热和光照稳定性。以左旋酪氨酸和左旋多巴为底物,铜藻多酚浓度为700μg/mL时,对酪氨酸酶活性的抑制率分别为92.68%和39.18%。

铁皮石斛与人参和葛根提取物组合对酪氨酸酶二酚酶活性的协同抑制效应研究

利用酪氨酸酶L-多巴速率氧化法,测定铁皮石斛分别和人参、葛根提取物组合对酪氨酸酶的活性抑制率,评价其协同抑制效果,为进一步应用提供参考。研究结果显示两组组合物对酪氨酸酶活性的抑制率均存在协同效应,且均在质量比为7:68时,其相互作用协同效应最大。

川芎、益母草有效成分配伍对酪氨酸酶活性、黑色素生成的抑制效应研究

目的:探索川芎与益母草有效成分配伍对酪氨酸酶活性和黑色素生成的影响。方法:采用左旋多巴氧化法测定川芎水煎液和益母草水煎以及川芎总生物碱和益母草总生物碱不同质量配比对酪氨酸酶活性的抑制作用,筛选出最佳组合进行后续实验。MTT法检测所筛选出的组合对B16细胞存活率的影响。随后实验分为细胞对照组、α-MSH诱导模型组和模型+所筛选出的最佳组合(50、100、200μg·mL^(-1))、模型+阳性组(曲酸,100μg·mL^(-1))。NaOH裂解法和多巴氧化法检测细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性。结果:通过筛选得出川芎总生物碱和益母草总生物碱质量比为1:2的组合效果最佳。药物配伍25、50、100、200、250μg·mL^(-1)对B16细胞无明显抑制作用。与空白组相比,模型组B16细胞中酪氨酸酶活性、黑色素水平增高(P<0.05,P<0.01),各剂量药物干预后,小鼠黑色素瘤细胞B16中酪氨酸酶活性、黑色素水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论:川芎总生物碱和益母草总生物碱质量比为1:2的组合对酪氨酸酶抑制效果最佳,且能显著抑制B16细胞内酪氨酸酶活性和黑色素的生成。

松茸的发酵条件优化及其对酪氨酸酶的抑制机理研究

为了提高松茸的抗酪氨酸酶活性,利用嗜酸乳杆菌对其进行发酵,并探究其活性变化机理。通过单因素试验法优化了发酵条件,采用苯酚-硫酸法、二喹啉甲酸法和HPLC分析发酵前后物质含量变化,通过酶反应动力学分析、铜离子螯合实验和酪氨酸酶荧光猝灭实验研究发酵样品和酪氨酸酶之间的相互作用。结果表明,在嗜酸乳杆菌接种量5%,松茸添加量4%,发酵时间4 d时发酵样品有最大的酪氨酸酶抑制率,IC_(50)值从发酵前的>10 mg/mL降低至(4.74±0.21)mg/mL。发酵提高了总蛋白和寡肽(<1000 Da)的含量,促进了具有生物活性的寡肽和游离氨基酸的释放。进一步的机理研究表明,发酵样品通过混合型可逆抑制的方式降低酪氨酸酶活性,并能够螯合铜离子,半螯合浓度为(9.14±0.04)mg/mL,且能猝灭酪氨酸酶内源性荧光,说明发酵样品可能通过与铜离子结合,占据酪氨酸酶的活性位点,从而抑制其活性。嗜酸乳杆菌的发酵处理能显著提高松茸的酪氨酸酶抑制能力,研究结果为其在化妆品和功能性食品领域的应用提供了科学依据。

西番莲果皮中一个具有抑制酪氨酸酶活性的新木脂素类化合物

本文研究西番莲(Passiflora edulis Sims)果皮化学成分及其抑制酪氨酸酶活性。采用半制备液相色谱法对西番莲果皮乙醇提取物进行了分离纯化,结合波谱数据和文献报道鉴定其化合物结构。利用酪氨酸酶试剂盒检测酪氨酸酶抑制活性,采用Autodock Vina及Gromacs软件实现化合物与酪氨酸酶蛋白的分子对接。最终从西番莲果皮中分离鉴定3个化合物,分别为肌醇木脂素(1)、松柏苷(2)和紫丁香苷(3),其中化合物1为新的新木脂素类化合物。3个化合物对酪氨酸酶抑制率分别为(27.27±0.79)%、(1.35±0.44)%和(17.04±0.86)%,与酪氨酸酶蛋白的结合能分别为-8.3、-6.9、和-6.7 kcal/mol,表明肌醇木脂素具有良好酪氨酸酶抑制活性,与酪氨酸酶蛋白结合作用强,且分子动力学模拟结果表明肌醇木脂素配体-酪氨酸酶复合物结合作用稳定,且具有潜在的酪氨酸酶抑制活性。

具有酪氨酸酶抑制活性的Broussonin C全合成及其结构简化

Broussonin C是从构树(Broussonetia papyrifera)中分离得到的一种1,3-二芳基丙烷类化合物,具有较好的酪氨酸酶抑制活性。本文以2,4-二羟基苯甲醛为起始原料,经6步反应得到broussonin C,实现其首次全合成。该法操作简单、收率高。同时,在类似物研究中发现,broussonin C无异戊烯基片段的结构类似物酪氨酸酶抑制活性更好,实现了对其结构的有效简化。

老瓜头乙酸乙酯提取部位化学成分及其抗氧化与酪氨酸酶抑制活性研究

为挖掘药用植物老瓜头的活性成分,对老瓜头全草的乙酸乙酯提取部位进行化学成分分离,并考察其抗氧化和酪氨酸酶抑制活性。采用各种色谱手段从中分离得到10个化合物,通过波谱学方法鉴定结构为3-甲氧基-4-羟基苯乙酮(1)、3,4-二甲氧基苯乙酮(2)、6,7-二甲氧基香豆素(3)、6-甲氧基-7-羟基香豆素(4)、对羟基苯丙酮(5)、对羟基苯乙酮(6)、10a,12a-dimethyl-4,4a,4b,10b,11,12-hexahydro-3H-naphtho[2,1-f]chromene-2,8-dione(7)、ent-13S-hydroxy-16-atisene-3,14-dione(8)、3-吲哚甲醛(9)、反式肉桂酸(10)。其中化合物7~10为首次从老瓜头中分离得到。分别通过DPPH自由基清除法和酪氨酸酶催化左旋多巴氧化速率法考察化合物的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性。结果表明化合物1、2、4和5对DPPH自由基有一定的清除能力,其IC50分别为37.3、44.3、51.4、48.2μg/mL。化合物1、2、3、4和6对酪氨酸酶有显著的抑制作用,其IC50分别为15.7、22.3、8.3、7.1、39.8μg/mL,均强于阳性对照熊果苷。

曲酸三氮唑氨基硫脲席夫碱的合成及抑制酪氨酸酶活性研究

本研究基于蘑菇酪氨酸酶晶体结构特点,设计并合成了11个曲酸三氮唑氨基硫脲席夫碱衍生物。抑制酪氨酸酶活性研究发现,所有化合物均能一定程度抑制酪氨酸酶活性,其中化合物7j抑制效果最好,其IC_(50)为1.584μM,优于阳性对照曲酸(IC_(50)为22.230μM);作用机制研究表明,该化合物为混合型抑制剂,不仅能与游离酶结合,还能与酶-底物复合物相结合,其K_(I)和K_(IS)分别为0.059 3μM和0.100 6μM;进一步的荧光猝灭和实际抗褐变结果表明该化合物不仅对酪氨酸酶有很好的动态猝灭作用,其实际抗褐变效果也优于曲酸和抗坏血酸;上述研究结果为开发安全、高效的酪氨酸酶抑制剂提供了理论依据。

侧柏叶有效成分提取及酪氨酸酶活性影响评价

目的:研究侧柏叶有效成分总黄酮的最佳提取工艺,并评价有效提取成分对酪氨酸酶活性的影响。方法:采用单因素试验、正交试验考察了提取过程中各因素对侧柏叶总黄酮含量的影响;采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法考察提取成分对酪氨酸酶活性的影响。结果:本实验确定最优的提取工艺为90%乙醇作为提取液,按照1∶15的料液比(g∶mL),以70℃的超声温度进行提取,超声时间为60 min,此条件下总黄酮提取量为1.394 mg/g。0.5 g/mL乙酸乙酯提取物的激活率最小,为-211.68%±2.42%;0.5 g/mL石油醚提取物的激活率最大,为20.30%±1.32%。结论:本研究确定了侧柏叶有效成分提取的最佳工艺,经过对有效成分活性测试可知,乙醇粗提取物和乙酸乙酯提取物对酪氨酸酶的活性有抑制作用且随着浓度升高而升高,石油醚提取物低浓度有抑制作用,高浓度有激活作用。

制首乌不同配伍方式对黑色素及酪氨酸酶活性的影响

目的观察制首乌不同配伍方式的水提物对黑色素上调率及酪氨酸酶活性的影响,优选制首乌“乌须发”最佳的配伍方式。方法分别采用蘑菇酪氨酸酶NaOH裂解法及多巴胺速率氧化法研究制首乌不同配伍方式对黑色素生物合成及酪氨酸酶活性的影响。结果制首乌不同配伍方式均具有黑色素上调的作用,整体表现为制首乌-黑芝麻>制首乌-侧柏叶>制首乌-桑椹>制首乌-女贞子,且在一定范围内呈一定的剂量依赖性;制首乌不同配伍方式对酪氨酸酶的激活率均不同,其中制首乌-侧柏叶和制首乌-桑椹对酪氨酸酶具有抑制作用,但是随着浓度的增加,抑制作用逐渐减弱;制首乌-黑芝麻和制首乌-女贞子对酪氨酸酶具有激活作用,制首乌-黑芝麻较制首乌-女贞子激活作用明显。结论制首乌-黑芝麻为制首乌“乌须发”的最佳配伍,制首乌-黑芝麻配伍能够激活酪氨酸酶的活性,上调黑色素含量。

基于文献计量分析酪氨酸酶抑制剂研究现状与发展趋势

为深入了解我国酪氨酸酶抑制剂的研究现状及发展趋势,以中国知网(CNKI)数据库为文献来源,检索2002年-2022年与酪氨酸酶抑制剂研究有关的文献,利用数据库自带的可视化分析功能,对检索到的文献进行分析。结果表明:国内近20年酪氨酸酶抑制剂文献年发文量总体呈现上升的趋势。高校是研究酪氨酸酶抑制剂的主力。我国酪氨酸酶抑制剂研究的高频关键词为酪氨酸酶、抑制剂、酪氨酸酶抑制、酪氨酸酶抑制剂活性、化学成分等,而有关酪氨酸酶抑制剂生理功能作用机制的研究文献较少。本研究为酪氨酸酶抑制剂后续的研究方向提供科学依据,并为其在医学领域的应用提供有力的参考。

具有抑制酪氨酸酶活性乳酸菌的筛选及其成分分析

以抑制酪氨酸酶活性为筛选指标,对5株乳酸菌发酵上清液、菌体细胞和破碎提取物的酪氨酸酶抑制活性和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率进行分析,结果表明,菌株发酵上清液抑制酪氨酸酶能力远高于菌体细胞和破碎提取物,其中MNJ-9菌株发酵上清液抑制酪氨酸酶能力可达68.9%。菌体细胞和破碎提取物仅为50.9%和34.8%。MNJ-9菌株发酵上清液对DPPH自由基清除能力可达93.1%。因此,对MNJ-9菌株进行16S rDNA菌种鉴定。基于液相色谱-质谱非靶向代谢组学对MNJ-9菌株发酵上清液进行主要成分分析。对其主要成分的10种化合物进行抑制率测定,结果表明,5-氨基戊酸抑制率最高。将5-氨基戊酸对小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)进行细胞毒性实验、黑色素含量测定、细胞酪氨酸酶活性测定评价其美白能力。结果表明,5-氨基戊酸质量浓度为70μg/mL连续培养72 h时细胞存活率≥80%,细胞无明显毒性;质量浓度为10~70μg/mL时,细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性分别为85.4%~45.2%和76.53%~40.5%,说明5-氨基戊酸具有一定的美白能力。