锦鲤酪氨酸酶基因序列分析及其在不同锦鲤品系不同组织中的表达

为了解色素控制基因与体色分布的关系,实验用分子克隆技术得到了锦鲤酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)cDNA基因序列,并利用半定量PCR的方法分析了酪氨酸酶基因在锦鲤不同品系和组织中的表达差异。实验得到了长约1 779 bp锦鲤酪氨酸酶cDNA基因,其包括长1 608 bp开放阅读框,编码535个氨基酸。cDNA、蛋白水平序列分析和系统发育分析都表明酪氨酸酶在鱼类间的保守性要高于鱼类与其他脊椎动物间的保守性。半定量分析研究显示,酪氨酸酶基因在皮肤、肝、心、脑和眼中都有表达,其中眼部和黑色皮肤表达最高,其次是脑,红色和黄色皮肤,肝和心的表达最低。不同品系同组织间眼、肝、心、脑的酪氨酸酶基因表达差异不显著,但是在皮肤中有差异表达,黑色皮肤表达最高,其次是红色和黄色皮肤,在白色皮肤中也有少量表达。酪氨酸酶基因在非黑色组织中有较高表达可能与存在多种形式酪氨酸酶有关,也有可能非黑色素细胞能转化为黑色素细胞。

眼皮肤白化病患者酪氨酸酶基因突变的研究

目的:对临床诊断为眼皮肤白化病(OCA)患者的酪氨酸酶(TYR)基因进行突变筛查,了解我国大陆OCA患者TYR基因突变类型,探讨基因突变对人TYR蛋白结构和功能的影响。方法:应用PCR技术,扩增患者及其父母的TYR基因外显子、外显子-内含子交界区及启动子区;以DNA序列测定技术,进行突变筛查与鉴定;利用生物信息学方法,对突变引起蛋白结构和功能的改变进行预测与分析。结果:在15名患者的30个TYR等位基因内,查明11种突变;其中错义突变5种(W400L、R299H、E294K、R77Q和K142M),无义突变3种(R116X、R278X和G295X),插入突变2种(929insC和232insGGG),剪切位点突变1种(IVS1-3 C>G);对4个突变W400L、R299H、929insC、232insGGG的生物信息学分析显示,突变的致病性与蛋白结构和功能的改变相关。结论:W400L占本研究所检出全部OCA1突变等位基因的30.0%(9/30),可能为中国大陆人群中较常见的TYR基因突变类型;应用生物信息学分析方法对TYR基因突变的致病性做出一些合理可能的解释是可行的。

酪氨酸酶基因遗传变异的研究进展

酪氨酸酶是黑色素生物合成过程中的限速酶,是酪氨酸酶基因表达的唯一产物。作者综述了酪氨酸酶基因的结构和功能及其在主要动物和人上的遗传变异,以便为酪氨酸酶基因的深入研究和应用提供借鉴。

一例白变猕猴的酪氨酸酶基因及病因分析

目的—对一例不同寻常的白变猕猴进行病因研究,以探讨其色素病变的分子机理。方法—利用DH-PLC分析及测序技术对酪氨酸酶基因进行突变研究。并检测了毛发黑色素含量、微量元素含量等;结果—白猴血液指标无异常变化,酪氨酸酶基因发生多处杂合突变。白猴黑色素含量仅为正常猴的67%,同时Fe元素含量高于正常值。结论—白猴色素变化与酪氨酶基因的多态杂合突变有关,又与血液中Fe元素含量升高有关,但二者之间是否有联系,有何种联系却尚待进一步研究。

水貂酪氨酸酶基因外显子1的鉴定及序列变异分析

根据GenBank中公布的雪貂（登录号：EF405957）、大熊猫（登录号：XM_002930310）、家犬（登录号：CFU42219）及猫（登录号：AY959314）的酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因DNA序列保守区域,设计1对特异性引物,利用PCR及克隆技术测定了短毛黑水貂、红眼白水貂和米黄色水貂的TYR基因外显子1部分序列,并对该序列进行了BLAST鉴定及变异位点分析,基于该基因编码氨基酸序列构建了16个物种的系统进化树。结果表明,测定的3种毛色水貂TYR基因序列长度均为796bp,包括795bp的外显子1和1bp 5′UTR,共检测到5个单一突变位点：g.A34G、g.T138A、g.T248C、g.A545G和g.C765A,包含4个错义突变：g.A34G（p.Ser12Gly）、g.T248C（p.Val83Ala）、g.A545G（p.Tyr182Cys）和g.C765A（p.His255Gln）,1个移码突变分别出现在短毛黑水貂和红眼白水貂个体间：g.T138A（p.Cys46＊）,获得TYR基因GenBank登录号分别为：短毛黑水貂（KJ198847）、红眼白水貂（KJ658343）和米黄色水貂（KJ152769）。水貂与雪貂、大熊猫、家犬、猫、家兔、猪、羊驼、山羊、绵羊、牛、人、猕猴、黑猩猩、原鸡和日本鹌鹑的TYR基因核苷酸序列同源性为72.8%～98.6%,相应氨基酸序列同源性为75.0%～98.1%。TYR基因分子进化树显示水貂与雪貂遗传关系最近,分化时间约为1000万年前,且与原鸡和日本鹌鹑亲缘关系最远。该结果为进一步开展TYR基因多态性与水貂毛色表型的相关性研究奠定了生物信息学基础。

嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在类产碱假单胞菌中的转移与表达

类产碱假单胞菌 (Pseudomonaspseudoalcaligenes)是从盐城市农村粪池中采集的自然病死蝇蛆体内分离的具有显著杀蛆作用的细菌 ,野外使用易受阳光中紫外线的影响而失活。黑色素具有很强的抗辐射作用。将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的质粒pWSY导入类产碱假单胞菌体内 ,使后者获得了稳定产生黑色素的能力。Southern杂交实验证实酪氨酸酶基因来源于嗜麦芽假单胞菌。SDS PAGE电泳显示该重组子体内额外表达了一分子量约为 1 8kD的蛋白 ,该蛋白很可能就是重组子表达的酪氨酸酶。经测定 ,重组子抗辐射作用明显增强 ,有效杀蛆时间显著延长 ,对畜。

磁共振成像评价腺病毒介导的酪氨酸酶基因在HepG2细胞的表达

目的以酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞,以磁共振成像(MRI)观察酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染体外细胞的效果。方法以不同数量酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞,以MRIT1加权像(T1WI)、T2加权像(T2WI)及短时间间隔反转恢复序列(STIR)扫描转染细胞。应用Masson-Fontana染色检测黑色素的合成,实时定量PCR验证酪氨酸酶基因的转染与表达。结果酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞并在其中表达生成黑色素,经转染复数分别为50、150、300的重组腺病毒转染的1×106个细胞内生成的黑色素能够被MRI检测到并在MRIT1WI、T2WI、STIR检查呈高信号。Masson-Fontana染色检测到转染的HepG2细胞内的黑色素颗粒;实时定量PCR在转染细胞中检测到的酪氨酸酶基因的cDNA表达量较未转染细胞的表达量明显增高。结论MRI能够检测到HepG2细胞由外源基因表达合成的黑色素,表明腺病毒作为运送载体可以有效地运送酪氨酸酶基因进入HepG2细胞。

嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

酪氨酸酶基因（mel）编码的酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶。用鸟枪法分离嗜麦芽假单胞菌（PseudomonasmaltophiliaAT18）的mel基因：以pUC18为载体，E．coliHB101为受体菌，在加有一定量的Amp和L－tyr的酪素平板上筛选到分泌可溶性黑色素的转化子，所含重组质粒pWSY约700bp的外源DNA片段上携有mel基因，该片段无BamHI、HindIII、EcoRI、BclI等酶的识别位点。Southern杂交证实此片段确实来源于P．maltophilia。克隆片段的核酸序列分析鉴定ORF504为酪氨酸酶编码序列，SDS－PAGE电泳也显示工程菌HB101／pWSY额外表达一分子量约为18kD的蛋白，因此证明了这一蛋白是重组子表达的酪氨酸酶。

略阳乌鸡酪氨酸酶基因(TYR)遗传变异分析

试验通过PCR-SSCP技术检测略阳乌鸡酪氨酸酶基因(TYR)部分启动子区、全部外显子和部分内含子的遗传多样性,并对不同基因型进行了测序和比对分析。结果表明,略阳鸡群体在TYR位点具有较为丰富的遗传变异,在所检测的启动子区有2个单核苷酸多态(SNP)位点;外显子1有2个SNP位点,外显子2、3、4没有检测到变异位点,外显子5存在5个SNP位点;检测的部分内含子2中发现2个SNP位点。mRNA上的7个变异位点有3个发生在编码区,但都是同义突变,没有造成氨基酸变异。表明略阳乌鸡和普通鸡的酪氨酸酶没有氨基酸序列差异,TYR基因在鸡的遗传上是高度保守的。启动子区和内含子区的遗传变异是否与酪氨酸酶的转录剪接和表达量有关,进而影响乌鸡黑色素的沉积还有待进一步研究。

黑线仓鼠及其白化突变系酪氨酸酶基因的克隆与序列分析

目的对黑线仓鼠及其白化突变系酪氨酸酶基因进行比较研究,揭示黑线仓鼠白化突变系白化性状产生的分子机理。方法根据小鼠与大鼠的酪氨酸酶基因保守区设计3对引物,利用RT-PCR方法 ,从黑线仓鼠及其白化系皮肤总RNA中扩增得到酪氨酸酶的cDNA基因,并对其二者进行克隆测序。结果成功获得了黑线仓鼠及其白化突变系的酪氨酸酶基因,对二者的序列比较分析结果表明,二者的编码区没有差异。结论黑线仓鼠白化突变系白化性状产生的原因与已知小鼠的白化性状产生原因不同,并不是由酪氨酸酶基因编码区突变造成的,其白化性状产生的机理有待进一步的研究。

小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的:克隆酪氨酸酶基因(TYR),并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白,体外测定纯化的TYR活性。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR,克隆至pMD18-T载体,进行双链核苷酸序列测定。构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaA-TYR并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115,表达的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析,采用Co2+离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性。结果:克隆了TYR基因。构建了重组表达质粒pPICZaA-TYR。SDS-PAGE和Western blot分析显示,在相对分子质量(Mr)为约53000处出现1条特异性蛋白带,且能与兔抗TYR抗体发生反应。结论:克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致,并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性。

苏云金杆菌酪氨酸酶基因转化子黑色素的研究

苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是使用广泛的杀虫细菌。将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的重组质粒导入苏云金杆菌体内,使后者获得了稳定产生黑色素的能力。所产黑色素是无定形物质,在大多数有机和无机溶剂中溶解度低或不溶解,在碱性溶液中有较好的溶解性,在中性及弱酸性溶液中溶解度低,pH<4时沉淀;可用过氧化氢或次氯酸钠氧化,也能被银离子或硫化氢还原;含有天然物质中少见的自由基,并能清除由紫外线诱导产生的自由基;能吸收所有波长的光线,在紫外波长下吸收值最大,能有效地保护紫外辐射对蛋白质及DNA等生物大分子物质的损害,具有很强的抗辐射作用。使转化子抗辐射能力显著增强,杀虫活性稳定保持;能抵抗病毒的侵袭,生长旺盛;对畜禽安全。

类产碱假单胞菌酪氨酸酶基因重组子所产黑色素性质的研究

将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的重组质粒导入从自然病死蝇蛆体内分离的具有显著杀蛆作用的类产碱假单胞菌体内 ,使后者获得了稳定产生黑色素的能力 ,具有很强的抗辐射作用。所产黑色素是无定形物质 ,在大多数有机和无机溶剂中溶解度低或不溶解 ,在碱性溶液中有较好的溶解性 ,在中性及弱酸性溶液中溶解度低 ,在pH <4的溶液中沉淀 ;可用过氧化氢或次氯酸钠氧化 ,也能被银离子或硫化氢还原 ;含有自由基 ,并能清除由紫外线诱导产生的自由基 ;能吸收所有波长的光线 ,在紫外波长下吸收值最大 ,能有效地保护紫外辐射对蛋白质及DNA等生物大分子物质的损害。

酪氨酸酶基因研究进展

酪氨酸酶(TYR)是合成黑色素的限速酶,其活性的高低直接影响着黑色素合成的种类和数量。本文综述了TYR基因结构及功能、表达调控以及该基因在物种上应用研究进展。

链霉菌酪氨酸酶基因的克隆与表达

本文综述了近年来对链霉菌酪氨酸酶基因的研究。由酪氨酸酶合成黑色素是链霉菌属各个种的共同特性，并受到酪氨酸酶基因的控制。链霉菌几个种的酪氨酸酶基因已克隆到，其产黑色素的特性使之作为重要的标记基因得以广泛应用，同时，该基因在链霉菌的不同种及不同属的微生物中得到了高水平的表达。链霉菌酪氨酸酶基因表达调控的分子机制也得到较深入的研究。

酪氨酸酶基因作报告基因的磁共振分子影像学研究进展

目前 ,应用包含人酪氨酸酶 (TYE)基因的表达载体作MRI的报告基因进行的初步研究已取得一定进展 ,现就TYE基因作MRI报告基因的应用机理。

半滑舌鳎酪氨酸酶基因(TYR)和多巴色素异构酶基因(DCT)的克隆表达与分析

作为我国鲆鳎鱼类中的一种主要养殖品种,半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)有时会发生无眼侧黑化(Melanism)、有眼侧白化(Albinism)的体色异常现象。本研究克隆了半滑舌鳎体色相关的酪氨酸酶基因(TYR)和多巴色素异构酶基因(DCT)的cDNA序列,并对这2个基因进行系统发育分析和时空表达分析。实验获得了TYR基因编码区cDNA序列长度为1620 bp,编码539个氨基酸;DCT基因编码区cDNA序列长度为1551 bp,编码516个氨基酸。结果显示,TYR和DCT在20日龄前的鱼苗体内表达量较高,尤其是在变态关键时期(15~20日龄)表达量最高,30日龄时的表达量锐减到很低水平;在其他时期的皮肤组织中,这2个基因在有眼侧正常皮肤和无眼侧黑化皮肤的表达量最高,在有眼侧白化皮肤和无眼侧正常皮肤中表达量极低;在其他时期的其他组织中,在眼睛中的表达量最高,其次是肝脏,在脾脏和肌肉中表达量极低。研究表明,TYR和DCT基因是半滑舌鳎无眼侧黑化发生和有眼侧体色维持的关键基因。本研究为查明半滑舌鳎体色异常机制提供了重要依据和参考。

苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶基因的克隆表达及应用初探

酪氨酸酶基因编码的酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶。采用比较酪氨酸酶的同源保守结构域氨基酸序列的方法设计引物 ,从苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis) 4D11中通过PCR扩增得到了包含酪氨酸酶基因的DNA片段。将该片段亚克隆到载体pGEM_7zf上并转入大肠杆菌DH5α ,所得到的转化子在添加了L_酪氨酸的LB培养基中能合成可溶性的黑色素。测定该菌株黑色素的产量和在紫外光照射后的菌体活力 。

虹鳟酪氨酸酶基因的生物信息学分析及其在不同发育阶段和组织中的表达分析

酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)基因在调控动物色素合成的过程中发挥关键作用。为了解tyr基因与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色变异的关系,本研究对虹鳟tyr-1和tyr-2基因进行了蛋白序列分析,并利用实时荧光定量PCR检测两种基因在野生型虹鳟(虹鳟)和黄色突变型虹鳟(金鳟)体色发生的19个不同时期和成鱼13种不同组织中的表达差异。蛋白序列分析结果表明,Tyr-1和Tyr-2都是亲水性蛋白,且蛋白结构主要是无规则卷曲和α-螺旋;实时荧光定量PCR结果显示,tyr-1基因在胚胎各时期均有表达,tyr-1基因表达量在虹鳟受精期最高,桑椹期次之,且显著高于其他时期(P<0.05);tyr-1基因表达量在金鳟16-细胞期最高,且显著高于其他时期(P<0.05);tyr-2基因分别从虹鳟囊胚期和金鳟原肠期开始表达,表达量均在心跳期达到最高且显著高于其他时期(P<0.05)。出膜后,tyr-1、tyr-2基因分别在虹鳟5日龄和金鳟3月龄表达量最高。在胚胎各时期中,tyr-1、tyr-2基因在虹鳟中表达量普遍高于金鳟,出膜后普遍低于金鳟。在各组织中,tyr-1基因在皮肤、眼睛、肾脏、肝脏等组织中有较高表达,tyr-2基因主要在皮肤、眼睛中有较高表达,在其他组织中表达量较低。以上结果表明,tyr-1和tyr-2基因与虹鳟体色变异具有一定的相关性,为深入阐明虹鳟体色变异机制和体色遗传改良奠定了理论基础。

一种具高活性的酪氨酸酶基因启动子片段的分离

利用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体，经ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ完全消化后与ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ部分消化的嗜麦芽假单胞菌染色休ＤＮＡ进行体外连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含氨苄青霉素（Ａｐ）和氯霉素（Ｃｍ）的选择平板上筛选转化子．从随机挑选的５４株转化子中，获得一株抗氯霉素水平达１０００ｍｇ／Ｌ的转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ，所含重组质粒被命名为ｐＡＳＩ．经限制性酶切分析和杂交分析表明，ｐＡＳＩ质粒上插入了一段来源于嗜麦芽假单胞菌染色体的ＤＮＡ片段，其大小为１．４ｋｂ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ在含Ｃｍ的培养基上，额外表达了一条２２×１０３的ＣＡＴ蛋白质带．将重组质粒ｐＷＳＹ上的嗜麦芽假单胞菌ｍｅｌ基因亚克隆到ｐＡＳＩ上１．４ｋｂ启动子功能片段下游，构建成Ｅ．ｃｏｌｉＡＷＳ工程菌株，使黑色素产率提高了７０．６％．