红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因克隆及表达分析

本文利用RACE技术克隆获得红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因全长,并利用生物信息学方法对该基因的m RNA序列特征、氨基酸序列特征、分类及系统发生进行了分析。结果表明,在红鳍笛鲷中,酪氨酸酶相关蛋白1基因含有TYRP1a和TYRP1b两个拷贝,其中TYRP1a序列全长3178bp,开放阅读框(ORF)长1566bp,5?端235bp,3?端1377bp;TYRP1b基因c DNA全长1871bp,ORF区长1656bp,5?端89bp,3?端126bp。序列分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因与其它物种的同源基因保守性较高,尤其是酪氨酸酶基因家族典型的酶活性位点序列在脊椎动物中具有高度保守性。进化分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因的种间同源性高于两个基因间的同源性。荧光定量PCR数据分析表明,TYRP1a和TYRP1b基因都在眼睛部位具有最高表达,TYRP1b在黑色皮肤也有较高表达。结果可为进一步阐述TYRP1基因在红鳍笛鲷身体和眼睛部位的色素合成机制提供一定的理论基础。

白癜风皮损黑素细胞HMB-45、酪氨酸酶及其相关蛋白1的免疫组化研究

目的:研究白癜风白斑处黑素细胞分布及酪氨酸酶(TYR)等标记分子的表达情况。方法:对吸疱法所取白斑皮肤以免疫组化染色识别TYR、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和HMB-45,以Mias99彩色图像分析软件定量图像分析阳性表达的强弱。结果:白斑处黑素细胞数目明显低于正常对照(P<0.01),患者非皮损处与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)。皮损处黑素细胞树突减少,平均为3.4个,低于对照组(P<0.05)。残留黑素细胞各抗体呈强阳性染色。白斑毛囊之间可见黑素细胞散在、呈围管样分布。白斑处阳性细胞HMB-45图像灰度值低于正常着色皮肤(P<0.05),而TRP1高于正常皮肤(P<0.01),TYR与正常皮肤无差异(P>0.05)。结论:白斑处仍然有黑素细胞。残存黑素细胞树突回缩、数目变少,而且黑素细胞中黑素细胞标记分子表达异常。

从大容量随机噬菌体抗体库筛选人源性抗酪氨酸酶相关蛋白1抗体

目的从大容量随机噬菌体抗体库中筛选人源性抗酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)单链抗体并进行鉴定及基因测序分析。方法以原核表达并纯化的TRP1为抗原,通过“吸附洗脱扩增”过程从大容量随机噬菌体抗体库中筛选特异性抗TRP1蛋白的单链抗体,分别通过ELISA和基因测序的方法对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果经过4轮筛选,获得18个能与TRP1蛋白结合的阳性克隆,其中3个克隆的噬菌体抗体能与TRP1特异性结合;基因测序分析表明,所获抗体分别属于不同的抗体克隆。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出高特异性的人源性抗TRP1抗体。

抗酪氨酸酶相关蛋白-1B细胞表位区多克隆抗体的制备及鉴定

目的 :制备多克隆抗体并初步用于TRP 1抗原表位区的研究 ,为白癜风、恶性黑素瘤的免疫治疗提供实验依据。方法 :在大肠杆菌中表达PRSETA/TRP 1融合蛋白 ,用所获得的蛋白免疫新西兰白兔得到多克隆抗体 ,并用ELISA、Western blot方法进行此抗体的鉴定。结果 :①表达了PRSETA/TRP 1融合蛋白 ;②制备了抗TRP 1B细胞表位区的多克隆抗体 ;③并用多克隆抗体检测了毕赤酵母表达的 6His TRP1蛋白 ,证实此抗体效价高、特异性强。结论 :此抗体可用于TRP

毛囊黑素细胞酪氨酸酶及相关蛋白1和2等分化标记分子的研究

目的:研究毛囊黑素细胞生物学特性,特别是与黑素合成相关酶蛋白和黑素小体结构蛋白在毛囊中的表达及分布情况。方法:取正常人头皮,采用HMB-45和识别酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)等抗体免疫组化染色黑素细胞,研究毛囊中黑素细胞的分布、形态及TYR、TRP1和TRP2等黑素细胞分化标记分子的表达情况。结果:有功能的黑素细胞位于毛漏斗部基底层和生长期毛母质内接近毛乳头处,毛母质黑素细胞树突计数均值为5.1,高于表皮黑素细胞(P<0.01)。毛髓质中黑素细胞与皮质细胞比值约为1∶4.2,而在基底层基底细胞与黑素细胞之比约为1∶9.7。毛球HMB-45,TYR,TRP1和TRP2阳性,阳性颗粒仅局限于毛皮质和毛髓质内。图像分析结果表明:毛球部黑素细胞HMB-45、TYR、TRP1灰度值低于表皮黑素细胞(P<0.05)、毛球部、毛漏斗部及表皮的黑素细胞TRP2灰度比较差异无显著性(P>0.05)。结论:毛囊中有活性的黑素细胞主要位于毛球和毛漏斗部,它们均表达黑素细胞分化标记抗原gp100、TYR、TRP1和TRP2。而且毛母质黑素细胞前3种分子表达量高于表皮黑素细胞。

抗酪氨酸酶抗体和抗酪氨酸酶相关蛋白-1抗体检测与快速进展期白癜风疗效的相关性分析

目的探讨快速进展期白癜风口服复方中药联合激素和免疫调节剂的临床疗效与抗酪氨酸酶抗体(TYR IgG)和抗酪氨酸酶相关蛋白-1抗体(TRP-1 IgG)检测结果的关系。方法 68例门诊快速进展期白癜风患者治疗前后用酶联免疫吸附法检测血清TYR IgG和TRP-1 IgG的含量。治疗用复方倍他米松注射液1 m L深部肌肉注射,外用0.1%他克莫司软膏,口服复方中药祛白颗粒。结果白癜风快速进展期治疗有效率为89.71%(61/68)。治疗后TYR IgG和TRP-1 IgG含量较治疗前显著降低(P<0.05)。儿童组(≤14岁)治疗后TYR IgG和治疗前及治疗后TRP-1 IgG水平均低于>14岁组(P<0.05)。面颈部白癜风治疗效果最好。治疗方法不良反应很轻,不影响治疗过程。结论 TYR IgG和TRP-1 IgG检测结果与白癜风治疗效果密切相关,为白癜风的疗效提供了证据,具有指导继续治疗的应用价值。应用激素、免疫调节剂和复方中药治疗进展期白癜风有较好的疗效。

miR-146a抑制酪氨酸酶基因家族在小鼠黑色素细胞中表达

miRNA是在许多生物过程中都起着至关重要作用的一类内源性非编码的小RNA,与癌症、肿瘤的发生有关。现发现很多miRNA在黑色素生成中都有重要的调控作用,但miR-146a是否对黑色素的生成具有影响未见报道。本研究发现miR-146a通过靶向抑制酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)的表达而使黑色素生成降低。在小鼠黑色素细胞中分别转染miR-146a mimic和miR-146a抑制剂,通过qRT-PCR与Western印迹分析比较各实验组中TYRP1基因与酪氨酸家族相关基因酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase related protein 2,TYRP2)的表达差异。双荧光报告实验验证TYRP1与miR-146a的靶向关系,双荧光酶活性结果显示,实验组相比对照组,荧光素酶活性明显降低,说明TYRP1是miR-146a的靶基因之一;qRT-PCR和Western印迹结果显示实验组TYR、TYRP1及TYRP2在mRNA水平和蛋白质水平表达均显著降低;紫外分光光度法检测黑色素含量,结果显示miR-146a mimic转染组黑色素含量明显下降,而抑制组的黑色素含量呈上升趋势。综上所述,miR-146a通过靶向抑制TYRP1基因的表达,而影响TYR家族成员的表达,调控黑色素的生物合成。

美洲水貂TYRP1基因编码蛋白质结构及功能的生物信息学分析

基于生物基因组学数据库,对美洲水貂酪氨酸酶相关蛋白质1(TYRP1)基因进行生物信息学分析,为其遗传特性及编码蛋白质功能机制的研究提供基础数据。生物信息学分析结果表明,美洲水貂TYRP1基因共编码537个氨基酸,其编码产物为不稳定的亲水蛋白质。二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主,含有1个酪氨酸酶超家族结构域,存在信号肽、跨膜结构域和二硫键。该蛋白质主要在内质网中发挥细胞被膜、运输和结合的作用,同时还通过信号转导在细胞内发挥其生物学作用。系统进化情况和动物分类学基本一致,美洲水貂和雪貂的亲缘关系最近。美洲水貂TYRP1基因编码蛋白质在生物进化中具有较强保守性,该基因结构和功能的分析为水貂TYRP1基因遗传特性的进一步研究奠定了基础。

人酪氨酸酶的同源模建研究

酪氨酸酶是皮肤黑色素生物合成过程中的限速酶,其抑制剂作为皮肤脱色剂具有重要的商业价值.目前尚无可用的人酪氨酸酶晶体结构,极大地限制了人酪氨酸酶抑制剂的研究.以人酪氨酸酶相关蛋白-1的晶体结构为模板,利用同源模建法对人酪氨酸酶的三维结构进行了模拟,采用分子对接对曲酸与人源模型和蘑菇酪氨酸酶的结合模式进行比较.随后采用分子动力学方法获得了稳定的复合物结构以获得更详细的信息.该研究为接下来的人酪氨酸酶抑制剂的虚拟筛选打下了基础,也为基于曲酸结构开发更高效的人酪氨酸酶抑制剂提供了思路.

TRP-1编码基因反义核酸对良恶性黑素细胞凋亡的影响

目的 观察TRP 1反义核酸对黑素细胞及恶性黑素瘤细胞凋亡的影响。方法 将TRP 1反义核酸真核表达载体转染至黑素细胞及恶性黑素瘤细胞 ,以透射电镜及流式细胞仪分别观察细胞的凋亡情况。结果 电镜下可见各期凋亡细胞及凋亡小体 ;流式细胞仪检测表明TRP 1反义核酸转染黑素细胞及空载体转染对照组黑素细胞的凋亡率分别为 2 4.4%及 1.2 % ,TRP 1反义核酸转染的恶性黑素瘤细胞及空载体转染对照组恶性黑素瘤细胞的凋亡率分别为7.0 %及 2 .2 %。结论 TRP 1基因在维持良、恶性黑素细胞生长方面发挥重要作用 ,其反义核酸能明显促进良恶性黑素细胞的凋亡。

植物激活蛋白对水稻抗性相关基因转录水平的影响

在cDNA芯片分析结果的基础上,对从交链孢真菌(Alternariaspp.)中提取的新型植物激活蛋白对水稻抗病相关基因转录水平的影响进行了研究,同时检测了抗病防御相关酶活性和稻瘟菌抗性的变化。结果表明,水稻幼苗经2μg·ml-1激活蛋白喷雾处理后,NPR1基因从第天时转录水平开始提高,第3天和5天时转录活性继续增强;EIN2基因的转录在第1天、3天时转录水平显著提高,第5天时又有所回复,但仍高于对照;CTR1的转录在第1天时虽无影响,但第3天和第5天转录水平明显降低,而PR4的转录在各检测时段均未表现明显变化。5d后叶片的稻瘟菌病情指数和平均每叶病斑数开始显著降低,14d时对稻瘟菌的诱抗效果最为明显。叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在处理后1d迅速增加,7d和9d时活性增加达到高峰期;β-1,3-葡聚糖酶活性在处理后3d开始增加,5d时增幅最大,随后增幅降低,14d时略低于对照水平;几丁质酶活性在处理后前3d低于对照,5d后活性平稳增加,14d时降至略低于对照的水平。

白癜风患者血清中抗酪氨酸酶IgG抗体及抗酪氨酸酶相关蛋白1IgG抗体的检测

目的探讨白癜风患者血清中抗酪氨酸酶IgG抗体（TYRIgG）和抗酪氨酸酶相关蛋白1IgG抗体（TRP-1IgG）与白癜风的关系。方法用酶联免疫吸附测定检测260例白癜风患者和50例健康对照血清中TYR1gG和TRP-1IgG的含量。结果白癜风组TYRIgG和（或）TRP-1IgG阳性率57．31％（149／260），TYRIgG阳性率37．3％（97／260），TRP-1IgG阳性率33．5％（87／260），均明显高于对照组（r=25．441、21．630，P〈0．01）。TYRIgG阳性与TRP-1IgG阳性不相关（r=-0．032，P〉0．05）。白癜风组TYRIgG阳性率男女间差异无统计学意义（P〉0．05），但TRP-1IgG阳性率女性高于男性（r=5．811，P〈0．05）。白癜风TYRIgG阳性率≤20岁（35．9％）与〉20岁（38.3％）比较，差异无统计学意义（P〉0．05），而TRP-1IgG阳性率≤20岁组明显高于〉20岁组（x^2=6．498，P〈0．05）。结论检测TYRIgG和TRP-1IgG可为白癜风的诊断和治疗提供一定依据。

非小细胞肺癌患者血浆 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO 基因甲基化状态观察

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆抑癌基因runt相关转录因子3(RUNX3)、ras相关结构域家族基因1A(RASSF1A)、3-0-硫基转移酶-2(3-OST-2)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因启动子区域的甲基化状态。方法采用甲基化特异PCR技术对63例NSCLC患者血浆中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因是否甲基化进行观察,并以25例健康人作对照。结果 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率分别为46.0%、50.8%、26.9%、34.9%、41.3%;健康人血浆中甲基化PTPRO基因检出率为12.0%,而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未检出;两者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率相比,P均<0.05。NSCLC患者血浆中上述5种甲基化基因联合检测的敏感度为88.9%、特异度为88.0%。血浆甲基化RUNX3基因检出率与NSCLC的病理类型、临床分期以及分化程度有关(P均<0.05);甲基化RASSF1A基因检出率与NSCLC的分化程度有关(P<0.05)。结论 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率明显高于健康人。联合检测血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能会有助于NSCLC的早期诊断及其生物学行为的判断。

6味中药乙醇提取物对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶及其相关蛋白-1、-2 mRNA表达的影响

目的研究墨旱莲(旱莲草)等6味用于治疗白癜风中药的乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白-1、-2(TRP-1、-2)mRNA表达的影响。方法半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定酪氨酸酶及TRP-1、-2 mRNA的表达,并与阳性对照甲氧沙林(8-MOP)进行比较。结果山慈姑(毛慈姑)、苦参、黑芝麻和墨旱莲的乙醇提取物显著上调细胞酪氨酸酶mRNA的表达(P<0.05);除苦参对TRP-2 mRNA有明显上调作用外(P<0.05),其他中药对TRP-1和TRP-2 mRNA的表达无明显作用(P>0.05)。结论山慈姑、苦参、黑芝麻和墨旱莲有上调酪氨酸酶mRNA的作用,苦参还可上调TRP-2 mRNA的表达。

TRP-1反义核酸抑制恶性黑素瘤细胞增殖的体外及体内研究

目的:观察TRP-1反义核酸在体内、外对恶性黑素瘤细胞增殖的抑制作用,探讨黑素瘤治疗的新途径。方法:构 建TRP-1反义核酸真核表达载体,将其转染恶性黑素瘤细胞,以测定的MTT结果绘制细胞生长曲线;进行黑素瘤细胞体外克 隆形成实验观察,计算各组细胞的克隆形成率;以TRP-1反义核酸转染的黑素瘤细胞及对照组细胞注射裸鼠,观察肿瘤大小 及增长速度。结果:从生长曲线可以看出,TRP-1反义核酸转染的黑素瘤细胞增殖速度明显低于对照细胞;体外克隆形成实验 结果显示:TRP-1反义核酸转染的黑素瘤细胞克隆形成率为52％,而对照组为68％(P<0.01);裸鼠成瘤试验表明,转染TRP- 1反义核酸的细胞成瘤性显著低于未转染细胞及转染载体对照细胞(P<0.01)。结论:TRP-1反义核酸在体内、外均能明显抑 制恶性黑素细胞的增殖,在恶性黑素瘤的治疗中有一定的应用前景。

西藏地区结直肠癌免疫治疗和靶向治疗相关分子标志物的检测及意义

目的研究西藏地区结直肠癌中SWI/SNF相关、基质相关、肌动蛋白依赖性染色质调节因子A亚科成员4(SMARCA4)/Brahma相关基因1、V-raf鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B(BRAF)、P53、程序性死亡受体1(PD-1)及程序性死亡配体1(PD-L1)免疫组织化学表达和BRAF、神经营养因子酪氨酸受体激酶(NTRK)基因改变情况,为西藏地区结直肠癌患者的靶向治疗及免疫治疗提供依据。方法收集2015年1月至2021年7月西藏自治区人民医院经手术切除病理确诊为结直肠癌病例64例,全部病例均进行SMARCA4、BRAF、P53、PD-1、PD-L1免疫组织化学染色和NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因荧光原位杂交检测及BRAF V600E基因突变PCR检测。结果64例结直肠癌病例男女比例1.21∶1,平均年龄(56.59±13.27)岁;46例(71.88%)位于结肠,18例(28.12%)位于直肠;60例(93.75%)为腺癌,4例(6.25%)为其他类型;11例(17.19%)为T1或T2期,53例(82.81%)为T3或T4期;24例(37.50%)出现淋巴结转移。免疫组织化学方面,64例中1例(1.56%)SMARCA4部分肿瘤细胞表达减弱或缺失,4例(6.25%)BRAF肿瘤细胞阳性表达,35例(54.69%)P53为突变型表达;45例(70.31%)PD-1肿瘤相关免疫细胞阳性比例分数<10%,19例(29.69%)≥10%;52例(81.25%)PD-L1联合阳性分数<10,12例(18.75%)≥10。64例NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因检测均为阴性;4例(6.25%)检测到BRAF V600E基因突变;1例SMARCA4表达缺失病例未检测到SMARCA4基因改变。PD-L1的表达与错配修复缺陷/高度微卫星不稳定和PD-1的高表达呈显著正相关(χ^(2)=10.223,P=0.001;χ^(2)=11.979,P=0.001)。结论西藏地区结直肠癌中较少出现SMARCA4表达减弱或缺失及NTRK融合基因改变,少数病例有BRAF V600E基因突变,Pan-TRK和BRAF免疫组织化学可作为NTRK融合基因及BRAF基因突变的初筛方法。错配修复缺陷/高度微卫星不稳定的病例中更容易出现PD-L1蛋白高表达,这部分患者有望获益于免疫治疗。P53突变与PD-L1表达无相关性,PD-1的高表达和PD-L1的高表达呈正相关。

TRP-1反义核酸转染黑素细胞 黑素瘤细胞的光镜及电镜观察

目的 观察TRP 1反义核酸真核表达载体转染的黑素细胞及黑素瘤细胞形态学改变, 探讨TRP 1功能。方法 将TRP 1反义核酸真核表达载体转染黑素细胞及黑素瘤细胞,以倒置光学显微镜及透射电镜分别观察细胞显微结构及超微结构的变化。结果 光镜下可见TRP 1反义核酸转染的黑素细胞及黑素瘤细胞树突变短粗,细胞胞体增大,呈上皮样细胞改变;电镜下可见线粒体变大,电子密度降低,溶酶体、脂滴、糖原颗粒增多,细胞核肿胀及凋亡细胞。结论 TRP 1在黑素细胞及黑素瘤细胞形态学改变中发挥重要作用,本研究为阐明TRP 1基因的功能提供较为全面的形态学证据。

HBV感染者血清抗TRP-1抗体与HSP70检测及相关性分析

目的检测HBV感染者血清抗TRP-1抗体及HSP70,并对二者的相关性进行分析。方法选取HBV感染组血清标本88例,其中大三阳组28例,小三阳组60例;抗体阳性组标本64例,其中既往感染组32例,疫苗接种组32例;全阴性对照组64例。用ELISA法检测所有标本抗TRP-1抗体及HSP70表达水平,对各组检测结果进行统计并分析两者的相关性。结果大三阳组、小三阳组、既往感染组、疫苗接种组、全阴性对照组血清标本中抗TRP-1抗体的OD值依次为2.071±0.574、1.855±0.873、0.166±0.068、0.220±0.048和0.260±0.034,抗TRP-1抗体阳性率分别为92.86%(26/28)、83.33%(50/60)、0%(0/32)、0%(0/32)和0%(0/64)。HSP70检测的OD值分别为2.135±0.456、1.816±0.874、0.165±0.073、0.166±0.042和0.206±0.033,高水平的HSP70占有率分别为100%(28/28)、83.33%(50/60)、0%(0/32)、0%(0/32)和0%(0/64)。经比较HBV感染组抗TRP-1抗体与HSP70表达水平显著高于抗体组及全阴性对照组(P<0.01)。高水平的抗TRP-1抗体与HSP70表达水平呈正相关(r=0.926,P<0.01)。抗体组与全阴性对照组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论大部分HBV感染者体内同时存在高水平抗TRP-1抗体及HSP70,两者呈正相关,可能是该类患者黑素细胞遭受破坏的早期标志,也是继发白癜风的重要原因。

中国家驴TYRP1基因第二内含子多态性分析

为了探究TYRP1基因对中国家驴毛色的影响,试验采集410只不同毛色中国家驴的血液样本,采用聚合酶链式反应及单链构象多态性(polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)方法检测中国家驴TYRP1基因第二内含子中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,对不同毛色中国家驴个体进行基因分型,并计算基因型频率和等位基因频率,分析TYRP1基因第二内含子多态性与中国家驴不同毛色之间的关系。结果表明:在中国家驴TYRP1基因第二内含子中检测到1个SNP位点(g.1 702A→G),该位点存在AA、AG、GG三种基因型;乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉、白色和白化家驴的优势等位基因均为A。乌头、黑三粉和青三粉均为AA基因型频率最高,GG基因型频率最低;灰三粉为AA基因型频率最高,AG基因型频率最低(0)。在乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉家驴中,AA基因型频率为灰三粉最高,然后依次为青三粉、黑三粉和乌头;以黑毛色为主色调的家驴(乌头、黑三粉、青三粉)GG基因型频率低于以灰毛色为主色调的家驴(灰三粉),有白毛混杂的黑三粉和青三粉的GG基因型频率低于纯黑的乌头。样本中的白色家驴和白化家驴各有2头,其基因型均为AA纯合子。说明随着中国家驴黑色被毛比例的增加,TYRP1基因g.1 702A→G位点的AA基因型频率逐渐降低,推测该位点可能与中国家驴毛色性状有关。