华泽兰根化学成分及其抑制α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶1B的活性研究

为研究华泽兰Eupatorium chinense根部的化学成分及其抗糖尿病活性,采用正相硅胶柱色谱、薄层色谱、凝胶柱色谱及半制备高效液相色谱等色谱方法,从华泽兰根部分离得到15个单体化合物,并通过现代波谱技术鉴定其结构分别为:8 S-9-hydroxythymol(1)、8,10-dehydro-9-hydroxythymol(2)、1-[4-hydroxy-3-methoxy-5-(3-methylbut-3-en-1-ynyl)phenyl]wethanone(3)、speciosin L(4)、(R)-8-hydroxy-9-isobutyryloxythymol(5)、1,4-[13C]-1,2,3,4-tetrahydro-5-naphthyl-amin(6)、eupatriol(7)、3β,6-hydroxytremetone(8)、泽兰酮(9)、(2 R,3 S)-5-acetyl-6-hydroxyl-2-isopropenyl-3-ethoxy-dihydrofuran(10)、(2 R,3 S)-5-乙酰基-6-羟基-2-异丙烯基-3-乙氧基-苯并二氢呋喃(11)、6-羟基-2 H-苯并呋喃-3-酮(12)、3,5-dimethyl-2,3-dihydrobenzofuran(13)、2,4-bis-(5-acetyl-6-hydroxy-benzofuran-2-yl)-4-methyl-pent-1-ene(14)、1,1′-[[(2 E)-4-methylpent-2-ene-2,4-diyl]bis(6-hydroxy-1-benzofuran-2,5-diyl)]diethanone(15)。其中化合物3为首次从泽兰属植物中分离获得,化合物14为首次从华泽兰中分离获得。采用对硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷法与对硝基苯磷酸盐法分别测定所有化合物对诱导糖尿病发生的α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制活性进行评价,化合物3、4、5和12具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其IC 50值分别为3.7、10.1、21.3、22.5μg/mL,其中化合物3的抑制活性优于良性药阿卡波糖(4.6μg/mL);化合物1、3、4和12具有良好的PTP1B抑制活性,其IC 50值分别为15.2、8.6、2.2和21.2μg/mL,其中化合物3的抑制活性优于良性药齐墩果酸(12.5μg/mL),化合物4的抑制活性优于阳性药正钒酸钠(7.5μg/mL)和齐墩果酸(12.5μg/mL)。研究表明,炔类化合物3和4均具有较明显的α-葡萄糖苷酶和PTP1B抑制活性。利用分子对接技术计算化合物3和4分别与α-葡萄糖苷酶和PTP1B的相互作用,结果表明化合物3和4与α-葡萄糖苷酶和PTP1B均具有较强的结合力。本论文首次采用双靶点对华泽兰根部的化学成分进行了抗糖尿病活性及构效研究,发现化合物3和4可作为抗糖尿病的先导化合物。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因位点IVS6+G82A多态性与肥胖相关性高血压研究

目的探讨PTP1B基因位点IVS6+G82A多态性与肥胖高血压的相关性。方法选取来自上海、南京地区汉族高血压患者393例(其中男性210例,女性183例;年龄25～70岁,平均年龄56.59岁)和非高血压患者266例(其中男性141例,女性125例;年龄28～72岁,平均年龄57.03岁),根据体质量指数(BMI)是否≥24kg/m2分为超质量高血压组242例,单纯高血压组151例,超质量对照组116例,正常对照组150例。运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定PTP1B基因位点IVS6+G82A的多态性。结果超质量高血压组GG基因型及等位基因G频率高于单纯高血压组、超质量对照组和正常对照组。多元逻辑回归分析显示在超质量人群中,位点IVS6+G82A等位基因G、性别、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、胰岛素敏感指数是高血压发病的独立相关因素。以AA基因型为参照,GG基因型患肥胖相关性高血压的比值比(OR)为2.29(P<0.01)。在超质量高血压组中,GG基因型人群血清TC、LDL-C水平高于AA和AG(P<0.05)基因型人群。结论位点IVS6+G82A变异与肥胖高血压相关,并与患者脂代谢异常相关。

蛋白酪氨酸磷脂酶-1B基因Pro387Leu变异与2型糖尿病的相关性研究

目的 探讨广州地区汉族人中蛋白酪氨酸磷脂酶 1B(PTP 1B)基因Pro387Leu变异与2型糖尿病 (T2DM)的相关性。 方法 随机选取无亲缘关系的广州地区汉族人 5 6 7例 ,其中T2DM患者 32 9例 ,正常对照 2 38例 ,应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)进行Pro387Leu变异的检测。 结果 正常对照组PTP 1BLeu 387携带者及Leu 387等位基因频率分别是 0 8%、0 4 % ,T2DM组相应为 0 6 %、0 3% ,两组比较差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。 结论 PTP 1B基因Pro387Leu变异与汉族人T2DM的发生不相关。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因多态性与妊娠期高血压疾病的相关性研究

目的测序妊娠期高血压疾病患者的蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因多态性,探讨其与妊娠期高血压疾病的相关性。方法随机选取该院2013年6月—2015年12月收治的子痫前期患者、妊娠期高血压患者、正常妊娠孕妇及正常体检人员各50例作为研究对象,测序其蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因的IVS6+G82A基因位点多态性,进行对比分析。结果子痫前期及妊娠期高血压患者GG基因型(40.00%、26.00%)以及G等位基因频率(62.00%、46.00%)显著高于正常妊娠(16.00%、40.00%)以及正常体检人员(14.00%、38.00%),P<0.05,差异有统计学意义。结论蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因IVS6+G82A位点多态性与妊娠期高血压疾病的发生存在一定相关性。

白癜风皮损黑素细胞HMB-45、酪氨酸酶及其相关蛋白1的免疫组化研究

目的:研究白癜风白斑处黑素细胞分布及酪氨酸酶(TYR)等标记分子的表达情况。方法:对吸疱法所取白斑皮肤以免疫组化染色识别TYR、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和HMB-45,以Mias99彩色图像分析软件定量图像分析阳性表达的强弱。结果:白斑处黑素细胞数目明显低于正常对照(P<0.01),患者非皮损处与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)。皮损处黑素细胞树突减少,平均为3.4个,低于对照组(P<0.05)。残留黑素细胞各抗体呈强阳性染色。白斑毛囊之间可见黑素细胞散在、呈围管样分布。白斑处阳性细胞HMB-45图像灰度值低于正常着色皮肤(P<0.05),而TRP1高于正常皮肤(P<0.01),TYR与正常皮肤无差异(P>0.05)。结论:白斑处仍然有黑素细胞。残存黑素细胞树突回缩、数目变少,而且黑素细胞中黑素细胞标记分子表达异常。

红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因克隆及表达分析

本文利用RACE技术克隆获得红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因全长,并利用生物信息学方法对该基因的m RNA序列特征、氨基酸序列特征、分类及系统发生进行了分析。结果表明,在红鳍笛鲷中,酪氨酸酶相关蛋白1基因含有TYRP1a和TYRP1b两个拷贝,其中TYRP1a序列全长3178bp,开放阅读框(ORF)长1566bp,5?端235bp,3?端1377bp;TYRP1b基因c DNA全长1871bp,ORF区长1656bp,5?端89bp,3?端126bp。序列分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因与其它物种的同源基因保守性较高,尤其是酪氨酸酶基因家族典型的酶活性位点序列在脊椎动物中具有高度保守性。进化分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因的种间同源性高于两个基因间的同源性。荧光定量PCR数据分析表明,TYRP1a和TYRP1b基因都在眼睛部位具有最高表达,TYRP1b在黑色皮肤也有较高表达。结果可为进一步阐述TYRP1基因在红鳍笛鲷身体和眼睛部位的色素合成机制提供一定的理论基础。

抗酪氨酸酶相关蛋白-1B细胞表位区多克隆抗体的制备及鉴定

目的 :制备多克隆抗体并初步用于TRP 1抗原表位区的研究 ,为白癜风、恶性黑素瘤的免疫治疗提供实验依据。方法 :在大肠杆菌中表达PRSETA/TRP 1融合蛋白 ,用所获得的蛋白免疫新西兰白兔得到多克隆抗体 ,并用ELISA、Western blot方法进行此抗体的鉴定。结果 :①表达了PRSETA/TRP 1融合蛋白 ;②制备了抗TRP 1B细胞表位区的多克隆抗体 ;③并用多克隆抗体检测了毕赤酵母表达的 6His TRP1蛋白 ,证实此抗体效价高、特异性强。结论 :此抗体可用于TRP

猪蛋白酪氨酸磷酸酶-1B基因第7内含子多态性与猪脂肪沉积性状的关联性

本研究旨在分析蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)基因部分SNP与猪脂肪沉积性状的关联性。选取国外瘦肉型猪种大约克夏16头、长白猪21头和中国脂肪型地方猪种梅山猪22头以及"大白×梅山"F2代资源家系213头为研究材料,利用PCR-Eco88I-RFLP方法检测PTP-1B基因第7内含子序列存在G/A突变的多态性,并进行方差分析。结果表明,大白和长白猪种为单一的A等位基因,而梅山猪种以杂合子GA基因型为主,对213头"大白×梅山"F2代资源家系进行性状关联分析,该位点与猪板油质量、内脂率、胸腰椎间背膘厚等脂肪沉积性状显著相关(P<0.05),且杂合子GA基因型个体的板油质量和内酯率都最低(GA基因型个体<GG基因型个体<AA基因型个体),这可能是杂种优势的体现。而GG基因型个体的胸腰椎间背膘厚最低(GG基因型个体<GA基因型个体<AA基因型个体)。结果提示,提高G等位基因频率可显著减少脂肪沉积,该SNP可能是改良猪脂肪沉积性状的重要分子标记位点。

从大容量随机噬菌体抗体库筛选人源性抗酪氨酸酶相关蛋白1抗体

目的从大容量随机噬菌体抗体库中筛选人源性抗酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)单链抗体并进行鉴定及基因测序分析。方法以原核表达并纯化的TRP1为抗原,通过“吸附洗脱扩增”过程从大容量随机噬菌体抗体库中筛选特异性抗TRP1蛋白的单链抗体,分别通过ELISA和基因测序的方法对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果经过4轮筛选,获得18个能与TRP1蛋白结合的阳性克隆,其中3个克隆的噬菌体抗体能与TRP1特异性结合;基因测序分析表明,所获抗体分别属于不同的抗体克隆。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出高特异性的人源性抗TRP1抗体。

毛囊黑素细胞酪氨酸酶及相关蛋白1和2等分化标记分子的研究

目的:研究毛囊黑素细胞生物学特性,特别是与黑素合成相关酶蛋白和黑素小体结构蛋白在毛囊中的表达及分布情况。方法:取正常人头皮,采用HMB-45和识别酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)等抗体免疫组化染色黑素细胞,研究毛囊中黑素细胞的分布、形态及TYR、TRP1和TRP2等黑素细胞分化标记分子的表达情况。结果:有功能的黑素细胞位于毛漏斗部基底层和生长期毛母质内接近毛乳头处,毛母质黑素细胞树突计数均值为5.1,高于表皮黑素细胞(P<0.01)。毛髓质中黑素细胞与皮质细胞比值约为1∶4.2,而在基底层基底细胞与黑素细胞之比约为1∶9.7。毛球HMB-45,TYR,TRP1和TRP2阳性,阳性颗粒仅局限于毛皮质和毛髓质内。图像分析结果表明:毛球部黑素细胞HMB-45、TYR、TRP1灰度值低于表皮黑素细胞(P<0.05)、毛球部、毛漏斗部及表皮的黑素细胞TRP2灰度比较差异无显著性(P>0.05)。结论:毛囊中有活性的黑素细胞主要位于毛球和毛漏斗部,它们均表达黑素细胞分化标记抗原gp100、TYR、TRP1和TRP2。而且毛母质黑素细胞前3种分子表达量高于表皮黑素细胞。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B的过度表达抑制GFAT的活性

为探讨蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)在细胞中的过度表达对氨基己糖途径之关键酶谷氨酰胺 :6 磷酸果糖酰基转移酶 (GFAT)的作用及其可能的作用机制。通过观察PTP1B在细胞内的过度表达对GFAT的活性及其终产物二磷酸尿嘧啶N 乙酰葡萄糖胺生成的影响及PTP抑制剂正钒酸盐的对抗作用 ,并测定对细胞内GFATmRNA水平和PTP1B对GFAT的直接作用等 ,发现PTP1B在L6、HepG2、3T3 L1和HIRc等细胞中的过度表达可明显抑制GFAT的活性 。

抗酪氨酸酶抗体和抗酪氨酸酶相关蛋白-1抗体检测与快速进展期白癜风疗效的相关性分析

目的探讨快速进展期白癜风口服复方中药联合激素和免疫调节剂的临床疗效与抗酪氨酸酶抗体(TYR IgG)和抗酪氨酸酶相关蛋白-1抗体(TRP-1 IgG)检测结果的关系。方法 68例门诊快速进展期白癜风患者治疗前后用酶联免疫吸附法检测血清TYR IgG和TRP-1 IgG的含量。治疗用复方倍他米松注射液1 m L深部肌肉注射,外用0.1%他克莫司软膏,口服复方中药祛白颗粒。结果白癜风快速进展期治疗有效率为89.71%(61/68)。治疗后TYR IgG和TRP-1 IgG含量较治疗前显著降低(P<0.05)。儿童组(≤14岁)治疗后TYR IgG和治疗前及治疗后TRP-1 IgG水平均低于>14岁组(P<0.05)。面颈部白癜风治疗效果最好。治疗方法不良反应很轻,不影响治疗过程。结论 TYR IgG和TRP-1 IgG检测结果与白癜风治疗效果密切相关,为白癜风的疗效提供了证据,具有指导继续治疗的应用价值。应用激素、免疫调节剂和复方中药治疗进展期白癜风有较好的疗效。

miR-146a抑制酪氨酸酶基因家族在小鼠黑色素细胞中表达

miRNA是在许多生物过程中都起着至关重要作用的一类内源性非编码的小RNA,与癌症、肿瘤的发生有关。现发现很多miRNA在黑色素生成中都有重要的调控作用,但miR-146a是否对黑色素的生成具有影响未见报道。本研究发现miR-146a通过靶向抑制酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)的表达而使黑色素生成降低。在小鼠黑色素细胞中分别转染miR-146a mimic和miR-146a抑制剂,通过qRT-PCR与Western印迹分析比较各实验组中TYRP1基因与酪氨酸家族相关基因酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase related protein 2,TYRP2)的表达差异。双荧光报告实验验证TYRP1与miR-146a的靶向关系,双荧光酶活性结果显示,实验组相比对照组,荧光素酶活性明显降低,说明TYRP1是miR-146a的靶基因之一;qRT-PCR和Western印迹结果显示实验组TYR、TYRP1及TYRP2在mRNA水平和蛋白质水平表达均显著降低;紫外分光光度法检测黑色素含量,结果显示miR-146a mimic转染组黑色素含量明显下降,而抑制组的黑色素含量呈上升趋势。综上所述,miR-146a通过靶向抑制TYRP1基因的表达,而影响TYR家族成员的表达,调控黑色素的生物合成。

靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B小分子干扰RNA对结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响

目的:探讨沉默蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因的RNA干扰对人结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响。方法:应用小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默PTP1B的表达(shRNA-PTP1B),采用逆转录聚合酶链反应和Western Blot分别在mRNA和蛋白水平检测抑制效果。CCK-8被用于检测沉默PTP1B表达对肿瘤细胞增殖的影响。在体外实验的基础上建立裸鼠模型,建立稳定表达干扰RNA细胞系,观察干扰RNA稳定表达对人结肠癌裸鼠移植成瘤的影响。结果:shRNA-PTP1B有效沉默LoVo细胞PTP1B mRNA及蛋白的表达,成功筛选shRNA-PTP1B稳定表达细胞株LoVo/shRNA细胞。在体外试验中与对照组比较LoVo/shRNA细胞的增殖能力明显下降。LoVo/shRNA细胞裸鼠移植成瘤体积,明显减小(P均<0.05)。结论:shRNA-PTP1B可以沉默人结肠癌PTP1B基因的表达,显著抑制LoVo细胞的增殖,降低LoVo细胞的成瘤能力。

斑马鱼TYRP1b基因SNPs筛查及其与体色性状的关联分析

【目的】探究酪氨酸酶相关蛋白1b(tyrosinase-related protein 1b,TYRP1b)基因变异与斑马鱼体色性状的相关性。【方法】以体色表型存在显著差异的红色、黄色和蓝色斑马鱼共计219个样本的肌肉组织DNA为模板,设计3对引物,采用PCR扩增、Sanger测序技术筛查TYRP1b基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),并将SNPs与斑马鱼体色性状进行关联分析。【结果】获得的斑马鱼TYRP1b基因外显子2、部分内含子3、外显子4、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6和外显子7长度分别为134、212、168、135、180、113、150、171 bp。SNPs筛查显示,3种体色斑马鱼群体共筛查到18个SNPs,部分内含子3存在11个SNPs位点:g.2125G>A、g.2150G>A、g.2152G>T、g.2161C>A、g.2175A>T、g.2180G>T、g.2185A>T、g.2192A>C、g.2200A>T、g.2201A>C和g.2213T>C;内含子4检测到4个SNPs位点:g.7C>A、g.65A>G、g.84T>A和g.103C>T;内含子5存在1个SNPs位点:g.61G>T;外显子4、6分别存在1个SNPs位点:g.125G>T和g.80T>A,且均为同义突变;外显子2、5和7均未检测到SNPs。关联分析表明,TYRP1b基因内含子3中g.2152G>T、g.2175A>T、g.2180T>G、g.2192A>C、g.2200A>T、g.2201A>C位点、内含子4中g.65A>G位点及外显子6中g.80T>A位点的基因型均与斑马鱼体色性状极显著相关(P<0.01)。【结论】斑马鱼TYRP1b基因内含子3、4及外显子6存在8个与体色表型存在关联的SNPs,可能影响斑马鱼体色性状或与之紧密连锁。

中国家驴TYRP1基因第二内含子多态性分析

为了探究TYRP1基因对中国家驴毛色的影响,试验采集410只不同毛色中国家驴的血液样本,采用聚合酶链式反应及单链构象多态性(polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)方法检测中国家驴TYRP1基因第二内含子中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,对不同毛色中国家驴个体进行基因分型,并计算基因型频率和等位基因频率,分析TYRP1基因第二内含子多态性与中国家驴不同毛色之间的关系。结果表明:在中国家驴TYRP1基因第二内含子中检测到1个SNP位点(g.1 702A→G),该位点存在AA、AG、GG三种基因型;乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉、白色和白化家驴的优势等位基因均为A。乌头、黑三粉和青三粉均为AA基因型频率最高,GG基因型频率最低;灰三粉为AA基因型频率最高,AG基因型频率最低(0)。在乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉家驴中,AA基因型频率为灰三粉最高,然后依次为青三粉、黑三粉和乌头;以黑毛色为主色调的家驴(乌头、黑三粉、青三粉)GG基因型频率低于以灰毛色为主色调的家驴(灰三粉),有白毛混杂的黑三粉和青三粉的GG基因型频率低于纯黑的乌头。样本中的白色家驴和白化家驴各有2头,其基因型均为AA纯合子。说明随着中国家驴黑色被毛比例的增加,TYRP1基因g.1 702A→G位点的AA基因型频率逐渐降低,推测该位点可能与中国家驴毛色性状有关。

人酪氨酸酶的同源模建研究

酪氨酸酶是皮肤黑色素生物合成过程中的限速酶,其抑制剂作为皮肤脱色剂具有重要的商业价值.目前尚无可用的人酪氨酸酶晶体结构,极大地限制了人酪氨酸酶抑制剂的研究.以人酪氨酸酶相关蛋白-1的晶体结构为模板,利用同源模建法对人酪氨酸酶的三维结构进行了模拟,采用分子对接对曲酸与人源模型和蘑菇酪氨酸酶的结合模式进行比较.随后采用分子动力学方法获得了稳定的复合物结构以获得更详细的信息.该研究为接下来的人酪氨酸酶抑制剂的虚拟筛选打下了基础,也为基于曲酸结构开发更高效的人酪氨酸酶抑制剂提供了思路.