天祝白牦牛α_(S1)-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(humanclottingfactorIX ,hFIX)的可行性 ,构建了包括山羊 β 酪蛋白基因启动子和外显子 1、内含子 1、外显子 2共约 6 .7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子 1的乳腺表达载体 ,通过转基因技术获得 12个原代转基因小鼠 (9♀ ,3♂ ) ,整合率为 11.2 %。经ELISA和Westernblot鉴定 8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性 ,其中一只的表达量高达5 2 .9mg/L ,其凝血活性亦高达 2 79.2 %。FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上。结果证明所构建的山羊 β 酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达 ,并能保持hFIX的生物活性。

中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白基因第四外显子多态性与产奶性状的关联分析

以544头中国荷斯坦奶牛为研究对象,以κ-酪蛋白基因为产奶性状的候选基因,扩增779bp的片段,结合测序结果采用PCR-RFLP方法来检测κ-酪蛋白基因3个位点的多态性。结果在exon4的第10891bp、10927bp和10988bp处分别发生了T/C、C/A错义突变和G/A同义突变,据此分别选择了TaqⅠ、HindⅢ、PstⅠ等3种限制性内切酶检测了其多态性。发现3个位点的A、B等位基因在群体中都有分布,且处于低度多态;A和B等位基因的频率分别为86.03%和13.97%;AA,AB和BB基因型频率分别为73.71%,24.63%和1.66%;χ2适合性检验表明,该群体在这3个位点的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);BB和AB基因型个体乳脂率显著高于AA基因型个体(P<0.05),AB基因型个体脂蛋白比显著高于AA基因型个体(P<0.05),但不同基因型对产奶量和乳蛋白率没有显著影响;3个位点的酶切多态性在所研究群体中是紧密连锁的。说明在中国荷斯坦奶牛群体中,κ-酪蛋白B等位基因可作为改良奶牛乳脂率性状的分子遗传标记。

牛αS1酪蛋白基因启动区的克隆和序列分析

牛αＳ１酪蛋白是牛奶蛋白的最主要成份。本研究利用λＥＭＢＬ３载体构建了牛基因组文库，并且从文库中分离克隆了牛αＳ１酪蛋白基因的启动区。利用自动测序仪，对牛αＳ１酪蛋白基因５′侧翼＋２９８～－１０８２的核苷酸顺序作了测定。经过与牛和其他物种的奶蛋白基因序列比较，推断了牛αＳ１酪蛋白基因的乳腺组织特异性转录因子和一般性核转录因子的结合位点。此外，本文还讨论了牛αＳ１酪蛋白基因启动区的利用前景。

精氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞体外生长及κ-酪蛋白基因表达的影响

本试验旨在研究培养基中添加不同浓度的精氨酸(Arg)对乳腺上皮细胞体外增殖及κ-酪蛋白(CSN3)基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,以无Arg的培养基(0.00 mg/L)为对照(0组),试验培养基分别添加69.50(0.25组)、139.00(0.50组)、278.00(1.00组)、556.00(2.00组)、1 112.00(4.00组)和2 224.00 mg/L(8.00组)的精氨酸。结果表明:Arg能促进乳腺上皮细胞的增殖,24 h时,0.25～4.00组与0组相比均差异显著(P<0.05),8.00组与0组相比差异不显著(P>0.05);48和72 h时,各试验组与0组相比均差异显著(P<0.05)。Arg能促进CSN3基因的表达,各试验组与0组相比均差异显著(P<0.05),当Arg浓度为556.00 mg/L时,CSN3基因表达量最高。结果提示,Arg对乳腺上皮细胞增殖及CSN3基因表达均具有明显的促进作用,且在Arg浓度为69.50～1 112.00 mg/L时促细胞增殖效果较佳,在Arg浓度为556.00 mg/L时促CSN3基因表达作用最强。

利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛β酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体,设计不同的同源臂,成功地敲除了β酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列,插入新的基因,研究其表达功能,或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。

中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联分析

【目的】研究中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联性,为培育高乳蛋白及高乳脂率奶牛提供参考依据。【方法】采用DNA测序、PCR-RFLP和CRS-PCR技术,对544头中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因的外显子4和5序列进行研究,通过SHEsis软件和PHASE软件进行配对连锁不平衡分析和单倍型分析。【结果】发现6个新的SNPs,包括外显子5上A12907G、G12950A、C12989T、A13028G、T12980C共5个SNP位点,证实前4个位点紧密连锁;外显子4上A10996T共1个SNP位点。单位点基因型与泌乳性状关联分析表明,A10996T突变位点的TT和AT基因型个体乳脂率显著高于AA基因型个体(P<0.05);T12980C突变位点的TC和CC基因型个体乳脂率、乳蛋白率分别极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)高于TT基因型个体;紧密连锁的4个突变位点的DE基因型个体乳脂率极显著高于DD基因型个体(P<0.01)。与泌乳性状的关联分析表明,共构建出7种单倍型,发现16种单倍型组合;其中H6H6单倍型组合个体乳脂率最高,H1H4次之;H1H4单倍型组合个体乳蛋白率最高;H5H6单倍型组合个体乳蛋白率及乳脂率最低。【结论】H1H4单倍型组合在乳蛋白率和乳脂率方面为有利单倍型组合,可作为选择高乳蛋白高乳脂率牛群的分子标记。

ht-PAm基因在山羊β-酪蛋白基因座定位整合的研究

利用体细胞基因打靶与核移植技术制备动物乳腺生物反应器是当今转基因定位整合表达的一种新技术。分别克隆山羊的 β_酪蛋白基因 5′调控区的 6 3kb片段 ,外显子 7、外显子 8和 9三个基因片段 ,并与克隆的人tPA突变体cDNA一起构建了含有neo和tk正负筛选标记基因的 β_酪蛋白基因打靶载体PGBC4tPA,并验证了neo基因、tk基因以及Cre_LoxP系统的有效性。将线性化的PGBC4tPA通过电转染整合到山羊胎儿成纤维细胞基因组中 ,利用G4 18和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选 ,初步获得抗性细胞克隆 2 4 4个 ,PCR检测后获得阳性细胞克隆 31个 ,其中初步验证 2个细胞克隆转植基因整合位点重组后的基因序列正确 ,并且该细胞克隆能够有效扩增。这为下一步基因打靶体细胞核移植制备山羊乳腺生物反应器奠定了基础。

大通牦牛生长激素基因和Κ-酪蛋白基因的PCR—RFLP研究

利用PCR-RFLP技术检测了大通牦牛生长激素(growth hormone,GH)基因和Κ-酪蛋白(Κ- casein,Κ-CN)基因部分序列的遗传多态性,结果表明:大通牦牛群体中被检测的两个位点均存在遗传多态 性。GH基因PCR—RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0．1755和0．8255;(?)-CN基因PCR-RFLP 位点等位基因A和B的基因频率分别为0．1117和0．8 883。GH基因和(?)-CN基因PCR-RFLP位点的基因 型分布均极显著偏离Hardy—Weinberg平衡定理(P<0．01)。大通牦牛群体内平均基因一致度和基因多样度分 别为0．7561和0．2439。

中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因多态性与产奶量的相关分析

本文利用ＰＣＲＲＦＬＰＳ方法对２６头中国荷斯坦牛κ酪蛋白基因进行分析，用ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ酶切发现了多态性。分析κ酪蛋白基因型与奶产量间的关系，第１胎ＢＢ基因型高于ＡＡ基因型，第２胎及总胎次ＡＡ基因型高于ＢＢ基因型。

牛α-sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达

将包括α－ｓｌ酪蛋白基因的启动子、ＬＡｔＰＡ小基因、α－ｓｌ酪蛋白基因下游调控序列的融合基 因经显微注射至小鼠的受精卵中，获得了５只转基因阳性鼠，其中１只转基因阳性雌鼠乳清中 ＬＡｔＰＡ的含量为０．１８μｇ／ｍｌ，说明构建的ＬＡｔＰＡ小基因能够正确表达出有生物活性的ＬＡｔＰＡ， 并且可在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠的乳汁中表达。

水牛κ-酪蛋白基因(CSN3)外显子4序列多态性研究

分别设计位于CSN3 5个外显子旁侧引物,采用DNA测序法对沼泽型和河流型水牛CSN3编码区结构进行了分析,并对10个水牛群体共106个样本CSN3第4外显子序列进行了变异检测。结果表明,两类水牛CSN3编码区由848个核苷酸组成,包括ORF序列573bp、5′-UTR序列69bp和3′-UTR序列206bp。在水牛CSN3第4外显子中共检测到4个SNP,其中c.445G>A,c.467C>T和c.516A>C为异义替换,导致相应的κ-CN成熟肽中氨基酸发生p.Val128Ile、p.Thr135Ile和p.Glu151Asp改变,c.467C>T和c.516A>C替换可能对κ-CN功能产生了影响。群体遗传分析表明,在河流型水牛中,等位基因c.445G、c.467C、c.471C和c.516A均为优势等位基因,而在沼泽型水牛中,仅c.445G、c.467C和c.471C为优势等位基因,河流型和沼泽型水牛的遗传差异主要体现在SNP516位点的群体遗传组成上。

山羊β-酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1- β6 .7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT-PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果 :构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。说明构建具有较长 5′端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。

奶牛β-酪蛋白基因5′和3′调控区的克隆及序列分析

利用普通及重组PCR技术克隆了奶牛β-酪蛋白基因(CSN2)5′调控成分(2826bp)和3′调控成分(620bp)。前者包括5′上游调控序列、第一外显子及部分第一内含子;后者主要包括最后一个不翻译的外显子和3′侧翼序列。纯化PCR产物通过pMD18-TVector亚克隆后测序并进行软件分析的结果表明,2个克隆片断与奶牛CSN2相应区域同源性分别为99.0%和98.0%,并且包含有全部的CSN2表达核心调控序列和多个转录、翻译因子的结合位点。

人gdnf基因的克隆及牛β-酪蛋白基因座定位整合载体的构建

用分子克隆技术构建人gdnf基因打靶牛β-casein基因座的正负筛选打靶载体,用于制备生产人GDNF的牛乳腺生物反应器。打靶载体以牛β-casein基因上游和下游5.7 kb序列为5′和3′同源臂;neo抗性基因为正筛选因子;HSV-tk基因和DsRed2基因为双负筛选因子;人gdnf基因置于5′同源臂下游,SV40 polyA序列插入到人gdnf基因下游作为人gdnf基因转录终止信号。经PCR、限制性内切酶图谱及DNA测序分析鉴定,结果表明已成功地构建了人gdnf基因打靶牛β-casein基因座的正负筛选打靶载体,为研究人gdnf基因在牛β-casein基因座的定点整合及通过体细胞核移植法制备人GDNF牛乳腺生物反应器的研究奠定了基础。

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcD-NA3(切除CMV启动子),构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。

草原红牛κ-酪蛋白基因的多态性及与泌乳性状关联性分析

为研究草原红牛κ-酪蛋白基因的多态性及与泌乳性状相关性,采用PCR-RFLP方法检测κ-酪蛋白基因外显子5的遗传多态性。结果检测到TT、TC和CC三种基因型,统计分析表明,此多态位点与草原红牛乳蛋白和乳糖呈显著相关,乳蛋白:CC基因型极显著高于CT基因型和TT基因型(P<0.01),而CT基因型也极显著高于TT基因型(P<0.01)。乳糖:TT基因型和TC基因型极显著高于CC基因型(P<0.01),而TT和TC基因型之间差异不显著(P>0.01)。其他泌乳性状的基因型间差异不显著(P>0.01)。结果表明,κ-CN基因对草原红牛乳蛋白和乳糖具有较大的遗传效应,可初步推断κ-CN是控制这一性状的众多基因之一,是影响草原红牛乳蛋白和乳糖的一个主效基因或与主效基因相连锁,可作为选育草原红牛高乳蛋白及低乳糖奶牛的分子标记,用于标记辅助选择意义重大。

牛β-酪蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建

利用PCR技术分3段克隆了长约9．7kb的牛β-酪蛋白基因,分另4克隆在pGEM-T easy Vector的T位点。经NCBI Blastn分析,与牛β-酪蛋白基因相应区段的同源性为98％。这3段序 列包含完整的5’侧翼序列、前8个外显子及第8个内含子的部分序列。以此构建了两个乳腺特 异性表达栽体:利用第1段和第2段共有的酶切位点将两段融合,作为5’调控区(6．8kb),第3段 和实验室已有的600 bp的加尾信号通过重组PCR拼接作为3’调控区(3．4kb)构建了一乳腺特异 性表达栽体;以第一段作为5’调控区,实验室已有的600bp加尾信号作为3’为调控区构建了另一 乳腺特异性表达载体。可以应用于进一步乳腺生物反应器的研制。

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。