肠型胃癌细胞中酪蛋白激酶2相互作用蛋白1与转化生长因子β_1表达的相关性

目的探讨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(CKIP-1)与转化生长因子β1(TGF-β1)在肠型胃癌细胞中表达的相关性。方法 Western blotting方法检测不同分化肠型胃癌细胞(高分化MKN28细胞、中分化SGC7901细胞和低分化BGC823、MKN45及AGS细胞)中CKIP-1与TGF-β1表达,Spearman相关性分析CKIP-1与TGF-β1表达相关性;分别构建过表达及干扰表达CKIP-1的人肠型腺癌MKN28细胞模型,Westernblotting方法检测各组细胞TGF-β1表达。结果与高分化胃癌MKN28细胞相比,中分化SGC7901细胞与低分化BGC823、MKN45及AGS细胞CKIP-1表达均降低、TGF-β1表达均升高(P <0.01);与中分化SGC7901细胞相比,低分化BGC823、MKN45及AGS细胞CKIP-1表达降低、TGF-β1表达升高(P <0.01);Spearman相关性分析显示不同分化肠型胃癌细胞中CKIP-1与TGF-β1表达负相关(r=-0.689 2,P <0.01)。与空白对照组相比,CKIP-1过表达组MKN28细胞TGF-β1表达下降(P <0.01),CKIP-1干扰表达组MKN28细胞TGF-β1表达增加(P <0.01)。结论肠型胃癌细胞中CKIP-1与TGF-β1蛋白表达负相关,CKIP-1蛋白可能通过负性上调TGF-β1表达后促进了肠型胃癌的恶性转化、发展及浸润转移。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的探讨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interacting protein-1,CKIP-1)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力的影响。方法收集正常人牙周膜组织,通过组织块培养法分离培养hPDLSCs,将P4代细胞分为空白对照组、阴性对照组(感染对照载体)、CKIP-1 siRNA慢病毒组(感染CKIP-1 siRNA慢病毒)以及CKIP-1组(感染CKIP-1过表达慢病毒)。对各组细胞进行成骨诱导培养21 d,茜素红染色观察细胞矿化结节形成情况,并用分光光度计法对矿化结节进行定量分析,同时利用qPCR技术检测各组Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alka-line phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)等,以及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路成骨相关调控因子的转录水平。结果阴性对照组与空白对照组各指标间无统计学差异(P>0.05);与阴性对照组比较,CKIP-1 siRNA慢病毒组出现更多的矿化结节(P<0.05),矿化沉积量明显增多(P<0.05),Runx2、ALP、OCN、RANKL等,以及BMP信号通路的转录水平不同程度升高(P<0.05)。结论CKIP-1下调可促进hP-DLSCs成骨分化能力,这与成骨相关调控因子转录水平有关。

RNA干扰受体相互作用蛋白激酶1基因表达对肾透明细胞癌生物活性的影响

目的探讨受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)对肾透明细胞癌(ccRCC)生物功能的影响及机制。方法通过RNA干扰技术降低RIPK1在ccRCC中的表达后,光镜观察细胞形态变化,CCK-8法检测细胞增殖变化情况,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力的变化,流式细胞仪检测细胞发生凋亡、坏死水平,Western blot法检测cleaved caspase-3、混合谱系蛋白激酶样结构域(MLKL)和RIPK3表达变化。结果小干扰RNA(siRNA)干扰48 h后,RIPK1-siRNA组细胞增殖吸光度值(0.563±0.042)低于NC-siRNA组(0.944±0.039;t=11.550,P=0.003);siRNA干扰72 h后,RIPK1-siRNA组吸光度值(0.408±0.019)低于NC-siRNA组(1.717±0.108;t=20.620,P<0.001)。与NC-siRNA组(72.000±12.120)比较,RIPK1-siRNA组(31.660±10.020)ccRCC细胞的迁移数量明显减少(t=4.442,P=0.011)。与NC-siRNA组(0.360±0.090、0.510±0.060、0.880±0.070)比较,RIPK1-siRNA组ccRCC细胞内cleaved caspase3、MLKL、RIPK3表达明显增加(0.780±0.070、1.490±0.100、1.680±0.130;t=6.380,P=0.003;t=8.656,P=0.001;t=14.150,P=0.001)。结论RIPK1是ccRCC内调控细胞增殖、死亡及迁移能力的重要基因,抑制RIPK1能够促进ccRCC发生凋亡及坏死性凋亡。

周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制物1A相互作用锌指蛋白1在临床相关疾病中的研究进展

周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制物1A相互作用锌指蛋白1(Ciz1)作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21^(Cip1/Waf1)的互相作用蛋白,不仅参与哺乳动物DNA复制,还参与细胞周期、细胞凋亡等生物学活动的调节。Ciz1在常见肿瘤(如肺癌、尤因肉瘤、结肠癌、胆囊癌、前列腺癌、乳腺癌)中过表达,表明Ciz1可能是肿瘤生长的驱动因素。Ciz1还与阿尔茨海默病、肌张力障碍等疾病发生相关。深入研究Ciz1与临床相关疾病的关系,可能为多种疾病的治疗提供新靶点。

缺氧诱导因子1α、Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3在儿童创伤性脑损伤中的表达及意义

目的动态观察缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B19kDa-interacting protein 3,BNIP3)在儿童创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)中的变化,并评估其预测儿童TBI病情轻重及预后的临床价值。方法前瞻性纳入2021年1月—2023年7月47例中重度TBI患儿为研究对象,根据格拉斯哥昏迷评分分为中度亚组(9~12分)和重度亚组(3~8分);以同期因腹股沟斜疝诊治且无基础疾病的30例患儿为对照组。比较各组HIF-1α、BNIP3、自噬相关蛋白Beclin-1及S100B水平的差异,采用受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)评估HIF-1α、BNIP3、Beclin-1及S100B对TBI病情轻重及预后的预测价值。结果TBI组患儿血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平高于对照组(P<0.05);TBI患儿中,重度亚组HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平高于中度亚组(P<0.05)。相关性分析显示,血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平与格拉斯哥昏迷评分呈负相关(P<0.05)。治疗7 d后,非手术TBI和手术TBI患儿的血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1及S100B水平均较治疗前下降(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平预测重度TBI的曲线下面积分别为0.782、0.835、0.872、0.880(P<0.05),预测TBI预后不良的曲线下面积分别为0.749、0.775、0.814、0.751(P<0.05)。结论TBI患儿血清HIF-1α、BNIP3及Beclin-1水平显著升高,检测其水平有助于临床判断TBI患儿的病情轻重及预后。

间充质干细胞外泌体调节哺乳动物雷帕霉素靶点/p70核糖体蛋白S6激酶/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白通路改善糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制研究

目的探讨间充质干细胞外泌体(MSC-EVs)通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1)/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白(Beclin 1)通路改善糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的机制。方法采用高脂饮食联合腹腔链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立SD大鼠DN模型,随机分为模型组、MSC-EVs组、MSC-EVs+MHY1485(mTOR激活剂)组,每组12只。另取12只SD大鼠以正常饲料喂养6周后,腹腔注射同等剂量柠檬酸钠溶液作为对照。以MSC-EVs和MHY1485分组处理后,检测大鼠血糖及肾功能指标[血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmALB)]水平。采用苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠肾组织病理形态;采用免疫组化检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路相关蛋白表达;采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路及自噬相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠肾组织形态发生损伤,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,MSC-EVs组大鼠肾组织形态损伤减轻,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著升高(P<0.05);与MSC-EVs组相比,MSC-EVs+MHY1485组大鼠肾组织形态损伤加重,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05)。结论MSC-EVs可增强自噬,降低DN大鼠血糖、SCr、BUN和尿蛋白水平,减轻肾组织损伤,其机制可能与抑制mTOR/S6K1/Beclin 1通路激活有关。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1基因沉默对胶质瘤U87-MG细胞增殖的影响

目的探讨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（Casein kinase 2-interacting protein-1，CKIP-1）基因沉默对人胶质瘤U87-MG细胞增殖的影响。方法构建CKIP-1 siRNA慢病毒干扰载体并感染U87-MG细胞，分别采用qRT—PCR和Westernblot检测CKIP-1 siRNA在U87-MG细胞中的敲减作用，采用流式细胞术检测细胞周期，细胞计数仪进行细胞计数，MTT和BrdU检测细胞增殖变化，克隆形成实验评价细胞生长能力的变化。结果与Ctrl组比较，CKIP-1siRNA能显著下调U87-MG细胞CKIP-1mRNA[Ctrl组（1．01±0．13），CKIP-1siRNA组（0．23＋0．02），P〈0．01]和蛋白表达水平。与Ctrl组比较，CKIP-1siRNA组G0／G1期细胞比例下降[Ctrl组（69．64±0．79）％，CKIP-1siRNA组（62．64±0．66）％，P〈0．01]，G2／M期细胞比例上升[Ctd组（8．36±0．52）％，CKIP一1siRNA组（13．87±2．90）％，P〈0．05]，细胞增殖能力和克隆形成能力受到明显抑制[细胞集落数：Ctd组（25±2）个／孔，CKIP-1siRNA组（2±1）个／孔，P〈0．01]。结论沉默U87-MG细胞中CKIP-1表达能显著抑制细胞增殖，表明CKIP-1蛋白可能参与胶质瘤的发生发展并促进胶质瘤细胞增殖。

受体相互作用蛋白激酶1介导坏死样凋亡参与心脑血管损伤及其抑制剂研究进展

坏死样凋亡是一种胱天蛋白酶非依赖性调节性细胞坏死方式,在心肌梗死、脑卒中、药源性心肌病和动脉粥样硬化等损伤相关性心脑疾病的进展中发挥重要作用。受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)是一种参与调节细胞坏死样凋亡的关键蛋白之一。RIPK1介导细胞坏死样凋亡参与(1)心肌损伤,如心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭和药源性心肌毒性等;(2)脑损伤,如脑缺血/再灌注损伤;(3)血管损伤,如动脉粥样硬化引起的血管内皮损伤。靶向抑制RIPK1能减少坏死样凋亡,对心脑血管损伤产生保护作用,表明RIPK1可能是治疗心、脑血管疾病潜在的靶点。目前已有多种类型RIPK1抑制剂,包括靶向RIPK1的D-天冬氨酸-高氨酸-甘氨酸残基中苯丙氨酸向内旋转从而与N端发生相互作用的活性构象的Ⅰ型,靶向RIPK1的D-天冬氨酸-亮氨酸-甘氨酸残基中苯丙氨酸朝外的非活性构象的ATP竞争性Ⅱ型和结合激酶结构域的疏水变构口袋的Ⅲ型,它们通过不同的靶点和机制抑制RIPK1的激酶活性,具有潜在的临床价值。本文综述了RIPK1依赖的坏死样凋亡的发生机制及其在心脑血管疾病中的作用,同时总结了RIPK1抑制剂的研究进展。

Eph受体相互作用蛋白B2-肝细胞激酶B4信号通路在正畸牙移动压力侧牙周改建中的作用

目的 探讨Eph受体相互作用蛋白B2(Ephrin B2)-肝细胞激酶B4(EphB4)信号通路在正畸牙移动(OTM)压力侧牙周改建中的作用。方法 36只大鼠分为对照组、OTM组和EphB4抑制剂(NVP-BHG712)组各12只。对照组应用相同未激活的正畸矫治器,OTM组和NVP-BHG712组建立OTM模型。NVP-BHG712组从应用正畸螺旋弹簧的第1天开始在左上颌第一磨牙附近牙周组织的颊舌侧皮下注射NVP-BHG712,连续治疗14天;对照组和OTM组只接受载体(0.1%乙酸)。比较三组OTM距离和骨密度、牙周膜结构、牙周组织炎症相关基因白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)的mRNA表达。结果 与第0 d比较,OTM过程中第4、7、14 d时第一磨牙压力侧EphrinB2和EphB4蛋白表达增加,并在第7 d时达到峰值。与OTM组比较,NVP-BHG712组第一磨牙和第二磨牙的距离较低,骨体积/组织体积比值、骨密度、骨小梁数、骨小梁间隙较高,骨小梁厚度显著降低(P<0.05)。OTM组IL-1、IL-6和TNF-α的表达显著高于NVP-BHG712组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EphrinB2-EphB4信号抑制可以减少骨密度的下降,抑制炎症因子的表达,并在OTM期间排列牙周韧带,为临床正畸治疗提供了新的途径。

受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)调控人结肠癌HT-29细胞程序性坏死的分子机制

目的研究受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)在人结肠HT-29细胞程序性坏死过程中的作用,并探讨E3泛素连接酶三重结构域包含蛋白16(tripartite domain containing protein 16,Trim16)对其作用的潜在调控机制。方法用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)建立HT-29细胞的程序性坏死模型,采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测其对凋亡、坏死细胞数目的影响。分别用Western blot和qRT-PCR检测RIPK1在细胞程序性坏死中的表达。构建稳定表达Flag标记的RIPK1的HT-29细胞株,采用Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现与RIPK1有相互作用的新蛋白。应用NiNTA pulldown试验检测筛选出的E3泛素连接酶对RIPK1泛素化的调控。结果 TNFα能够成功诱导HT-29细胞程序性坏死。HT-29细胞在TNFα和半胱天蛋白酶抑制剂z-VAD处理后,表现出RIPK1、RIPK3、混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)表达水平显著增加,并伴随着炎性因子白介素1α(IL1α)和白介素6(IL6)水平明显升高。Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现一个与RIPK1有相互作用的E3泛素连接酶Trim16,体外实验表明Trim16可以增强RIPK1的泛素化程度,其可能调节RIPK1在程序性坏死过程中的作用。结论 RIPK1在TNFα和z-VAD诱导人结肠癌HT-29细胞的程序性坏死过程中起重要作用,E3泛素连接酶Trim16对此过程可能有重要调控作用。

miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路的影响

目的:观察miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路的影响。方法:将大鼠随机数字法分为模型组、miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组。建模后,模型组经尾静脉注射10 mL/kg生理盐水,miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组分别经尾静脉注射7μL miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor与RNAi脂质体转染试剂的混合溶液。各组大鼠苏醒后的24 h进行神经功能评分,测定脑梗死体积、大鼠脑组织含水量,检测缺血侧大脑皮质细胞凋亡率,caspase-3、Bax、Bcl-2和ERK1/2蛋白表达。结果:miR-17-5p mimics组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率明显低于模型组,miR-17-5p inhibitor组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率显著高于其他2组;miR-17-5p mimics组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax蛋白表达明显低于模型组,Bcl-2、p-ERK1/2蛋白表达高于模型组;miR-17-5p inhibitor组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax、p-ERK1/2蛋白表达显著高于其他2组,Bcl-2蛋白表达低于其他2组。结论:miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的脑损伤具有一定的保护作用,miR-17-5p可抑制ERK1/2信号通路激活。

端粒酶卡扎尔体蛋白1和PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1在乳腺浸润性导管癌患者中的表达及临床意义

目的 探讨端粒酶卡扎尔体蛋白1(TCAB1)和PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1)在乳腺浸润性导管癌患者中的表达及临床意义。方法 选取45例乳腺浸润性导管癌患者和45例乳腺纤维腺瘤患者,收集乳腺浸润性导管癌组织和乳腺纤维腺瘤组织,采用免疫组化染色法检测TCAB1和PINX1的表达情况。比较乳腺浸润性导管癌组织与乳腺纤维腺瘤组织中TCAB1和PINX1的表达情况,比较不同临床特征乳腺浸润性导管癌患者乳腺浸润性导管癌组织中TCAB1和PINX1的表达情况,采用Spearman相关分析法分析乳腺浸润性导管癌组织中TCAB1与PINX1表达的相关性。结果 乳腺浸润性导管癌组织中TCAB1高表达率明显高于乳腺纤维腺瘤组织,PINX1高表达率明显低于乳腺纤维腺瘤组织,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。无淋巴结转移、组织学分级为Ⅱ级的乳腺浸润性导管癌患者乳腺浸润性导管癌组织中PINX1高表达率分别明显高于淋巴结转移、组织学分级为Ⅲ级的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。乳腺浸润性导管癌组织中TCAB1与PINX1的表达呈负相关(r=-0.328,P=0.028)。结论 乳腺浸润性导管癌患者中TCAB1高表达率较高,PINX1高表达率较低,二者的表达呈负相关,且PINX1表达与淋巴结转移情况和组织学分级密切相关。

酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1介导的自噬通路与骨质疏松症的关系探讨

骨质疏松症被认为是一种典型的增龄性疾病,其原因是骨重建受损,并伴有成骨细胞和破骨细胞数量和活性的失衡。自噬作为一种细胞生存途径,在成骨细胞或破骨细胞退变过程中起着重要作用。酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1(casein kinase 2 interacting protein-1,CKIP-1)可以通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路参与骨细胞自噬,被认为与骨质疏松症的发生具有重要的关系。本文阐述了自噬的概念及发生机制,介绍了自噬与骨质疏松症的关系,重点探讨了CKIP-1介导的自噬通路与骨质疏松症的关系。

AAK1相互作用蛋白的筛选及其调控细胞内整体翻译水平的研究

目的·探究衔接子相关蛋白激酶1(adaptor-associated protein kinase 1,AAK1)新的相互作用蛋白,以及除网格蛋白介导的内吞作用外AAK1介导的生物学功能。方法·通过在HEK-293T细胞中分别外源性转染带有标签的AAK1载体与空白对照载体,利用标签特异性的琼脂糖凝胶进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CoIP),并联合质谱分析的方法获得潜在与AAK1相互作用的蛋白;通过CoIP初步验证质谱结果;通过荧光共聚焦成像观察AAK1与其潜在结合蛋白在细胞内的空间定位;通过体外纯化重组蛋白,利用谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白沉降实验(glutathione-S-transferase pulldown,GST Pulldown)进一步明确蛋白间是否为直接的相互作用;通过嘌呤霉素结合实验观察AAK1对于细胞内整体翻译水平的调控作用。结果·质谱结果提示AAK1可能与以脆性X相关蛋白1(fragile X mental retardation syndrome-related protein 1,FXR1)、FXR2、脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein 1,FMRP)三者为核心的一系列蛋白形成复合体。外源性转染AAK1-3xFLAG及FMRP-MYC质粒,利用抗FLAG琼脂糖凝胶富集AAK1-3xFLAG后,可以检测到FMRPMYC的表达;利用内源性抗体进行CoIP,发现富集AAK1可以检测到FMRP的表达。荧光共聚焦成像显示EGFP-AAK1与mCherry-FMRP在细胞质中存在部分空间共定位。GST Pulldown显示FMRP可以直接沉淀HIS6-AAK1重组蛋白。嘌呤霉素结合实验显示相同时间内嘌呤霉素标记的细胞内新合成肽段数量与AAK1蛋白表达量呈正相关。结论·AAK1与FMRP在细胞质内存在直接的相互作用,且AAK1可以提高细胞内的翻译水平。

蛋白激酶全抑制分析揭示KG-1细胞增殖的分子机制

目的:通过分析KG-1细胞对各种蛋白激酶抑制剂的反应,探讨其增殖的分子机制。方法:采用CCK-8法、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western-blot检测各种蛋白激酶抑制剂对KG-1细胞增殖、相关基因mRNA表达水平以及FGFR1下游信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:NVP-BGJ398和PD173074有效抑制KG-1细胞的增殖,表明FGFR及其下游信号通路在KG-1细胞增殖过程中具有关键作用。使用FGFR抑制剂处理后,p-FGFR1和p-STAT5水平显著下降(P<0.001),p-Akt水平稍有下降(P<0.05),并未影响p-ERK水平(P>0.05)。结论:FGFR1OP2-FGFR1主要作用于下游STAT5信号通路,以促进细胞增殖。蛋白激酶全抑制分析是一种可靠而直接的方法,可用于确定癌细胞增殖的分子机制。

A型流感病毒PB1-F2蛋白与蛋白激酶R相互作用研究

为研究A型流感病毒的重要毒力因子PB1-F2对蛋白激酶R(PKR)的调控机制,通过纯化GST-PB1-F2融合蛋白,利用GST pull-down试验证实了PB1-F2与PKR发生相互作用;采用免疫荧光试验进一步验证了二者的相互关系;实时荧光定量PCR表明PB1-F2能负调控PKR及IL-6的mRNA水平;采用siRNA干扰PKR基因的表达后,PB1-F2抑制IL-6的mRNA转录作用更显著。进一步运用蛋白免疫印迹方法检测了PB1-F2对PKR及其底物eIF-2α蛋白磷酸化水平的影响,显示过表达PB1-F2后,PKR及eIF-2α的磷酸化表达水平明显下调。本研究表明PB1-F2与PKR相互作用而抑制PKR磷酸化活化,并通过PKR调控IL-6的表达,为探索PB1-F2的未知生物学功能提供了重要信息。

醛缩酶A可与人蛋白激酶CK2α′亚基发生特异相互作用

通过PCR扩增构建的重组质粒pTHCKA′获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将PstⅠ NdeⅠ双酶切的PCR产物 ,连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7,构建为酵母双杂交穿梭表达质粒 (BD质粒 ) ,经DNA测序确证及转染感受态酵母菌AH10 9以排除自主激活 .从体外培养的HL 6 0细胞中提取总RNA ,采用CLONTECHSMART(switchingmechanismat 5′endofRNAtranscript)技术 ,在酵母细胞中构建HL 6 0细胞的酵母双杂交cDNA文库 ,将构建的BD质粒、文库cDNA、酵母穿梭表达质粒pGADT7 Rec ,共转染感受态酵母菌AH10 9进行酵母双杂交实验 .筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白 .筛选结果及一对一回复性实验显示 ,有 6种与CK2α′相互作用蛋白 ,核酸序列分析及同源性检索表明 ,其中 1种与醛缩酶A有高度同源性 (99 6 % ) .

GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。

5-硝基-1H-吲哚-2-羧酸与牛血红蛋白相互作用的分子模拟与光谱研究

运用密度泛函理论B3LYP/6-31G*方法对5-硝基-1H-吲哚-2-羧酸(NIA)的几何构型进行了全优化。在这基础上,用分子对接技术确定了NIA与牛血红蛋白(BHb)之间的作用位点、作用力类型及相互作用能。理论计算的结果表明NIA和BHb相互作用的静电能是-208.9 kcal.mol-1,范德华能为-180.5 kcal.mol-1,势能为-389.4 kcal.mol-1。NIA与BHb中A链上的Leu129、Ser133残基形成氢键,而NIA分子中的骨架苯环部分易与疏水氨基酸,包括产生荧光的Tyr残基等发生作用,这与NIA能使BHb荧光淬灭的实验结果是一致的。

草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。